高效液相色譜-PPT課件

1 二 定義色譜法 Chromatography 利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù) 2 色譜法的分離原理 利用樣品混合物中各組分理 化性質(zhì)的不同以及在兩相間分配系數(shù)的差異 當(dāng)兩相相對(duì)移動(dòng)時(shí) 各組分在兩相中反復(fù)多次重新分配 結(jié)果使混合物得到分離 兩相中 固定不動(dòng)的一相稱固定相 Stationaryphase 移動(dòng)的一相稱流動(dòng)相 Mobilephase 攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體 3 色譜發(fā)展史 100年前 俄國的植物學(xué)家Tswett創(chuàng)立了色譜法 由Tswett創(chuàng)立的色譜法分離效率低 分離時(shí)間長 根據(jù)樣品的不同 一般分離需要幾小時(shí)至幾天 20世紀(jì)40年代至50年代初 先后出現(xiàn)了紙色譜 paperchromatography PC 和薄膜色譜法 thin layerchromatography TLC 特點(diǎn) 較經(jīng)典色譜法簡單 分離時(shí)間短 樣品量要求小 1952年 James和Martin提出了氣相色譜法 gaschromatography GC 特點(diǎn) 以氣體作為流動(dòng)相 應(yīng)用范圍廣泛受到人們重視 但對(duì)不易氣化和熱不穩(wěn)定性差的化合物難以分離 20世紀(jì)60年代后期由于新型色譜柱填料的 高壓輸液泵和高靈敏度的檢測(cè)器的出現(xiàn) 發(fā)展出了高效液相色譜 Highperformanceliquidchromatography HPLC 4 液相色譜 以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn) 大分子 強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用 5 一 液 固吸附色譜 一 分離原理 二 常用吸附劑 三 吸附劑和流動(dòng)相的選擇 經(jīng)典液相色譜 6 一 分離原理各組分與流動(dòng)相分子爭奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑表面的活性吸附中心對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離 二 常用吸附劑 多孔 微粒狀物質(zhì)1 硅膠2 氧化鋁3 聚酰胺 7 1 硅膠 結(jié)構(gòu) 內(nèi)部 硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu) 多孔結(jié)構(gòu)表面 有硅醇基 氫鍵作用 吸附活性中心 特性 1 與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性 吸附能力 強(qiáng)極性吸附中心 不易洗脫2 吸水 失活 105 110OC烘干30分鐘 可逆失水 吸附力最大 500OC烘干 不可逆失水 活性喪失 無吸附力 適用 分析酸性或中性物質(zhì) 8 2 氧化鋁堿性氧化鋁pH9 10適于分析堿性 中性物質(zhì)中性氧化鋁pH 7 5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁pH4 5適于分析酸性 中性物質(zhì) 3 聚酰胺氫鍵作用氫鍵能力 強(qiáng) 組分越后出柱 9 三 吸附劑和流動(dòng)相的選擇 依據(jù)被測(cè)組分 吸附劑和流動(dòng)相的性質(zhì) 1 被測(cè)組分性質(zhì) 極性大小 烴 羧酸 醇2 吸附劑的活性 吸附劑的活性 大 對(duì)被測(cè)組分的吸附能力 強(qiáng)強(qiáng)極性物質(zhì) 選擇弱吸附劑弱極性物質(zhì) 選擇強(qiáng)吸附劑3 流動(dòng)相的極性 流動(dòng)相極性 大 對(duì)被測(cè)組分的洗脫能力 大 相似相溶 原則 根據(jù)組分性質(zhì) 吸附劑的活性 選擇適當(dāng)極性的流動(dòng)相 10 4 三者關(guān)系圖示 組分吸附劑流動(dòng)相極性活性小極性非 弱 極性活性大非極性或弱極性 11 二 薄層色譜法 一 概述 二 定性參數(shù) 三 吸附劑的選擇 四 展開劑的選擇 五 薄層板的制備 六 定性與定量分析 12 一 概述 1 定義 將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上 形成薄層而進(jìn)行色譜分離和分析的方法 2 操作過程 鋪板 活化 點(diǎn)樣 展開 定位 定性 洗脫 定量 3 分離機(jī)制 吸附 分配 離子交換 空間排阻 4 特點(diǎn) 分析快速 靈敏 顯色方便5 應(yīng)用 藥物雜質(zhì)檢查 純度測(cè)定 13 14 L0 L1 L2 15 二 定性參數(shù) 1 比移值Rf 討論Rf與組分性質(zhì) 溶解度 以及薄層板和展開劑的性質(zhì)有關(guān)色譜條件一定 Rf只與組分性質(zhì)有關(guān) 是薄層色譜基本定性參數(shù) 說明組分的色譜保留行為 16 1 K 大 Rf 小2 薄層板一定 對(duì)于極性組分展開劑極性 大 Rf 大 容易洗脫 展開劑極性 小 Rf 小 不容易洗脫 3 Rf范圍 0 Rf 1 組分遷移速度和距離小于展開劑遷移速度和距離 Rf 0 2 0 8 常用 0 3 0 5 最佳 17 2 相對(duì)比移值Rs 參考物與被測(cè)組分在完全相同條件下展開可以消除系統(tǒng)誤差 大大提高重現(xiàn)性和可靠性 參考物可以是后加入純物質(zhì) 也可為樣品中已知組分相對(duì)比移值Rs與組分 參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān) 范圍可以大于或小于1 18 三 吸附劑的選擇根據(jù)被測(cè)物極性和吸附劑的吸附能力被測(cè)物極性強(qiáng) 弱極性吸附劑被測(cè)物極性弱 強(qiáng)極性吸附劑 四 展開劑的選擇 同液固吸附色譜流動(dòng)相的選擇 根據(jù)被測(cè)組分 吸附劑和展開劑本身的極性 19 五 薄層板的制備 六 定性與定量分析定性分析 日光 紫外光 顯色定量分析 洗脫法 薄層掃描法 20 三 紙色譜法 將固定相放在紙上 以紙做載體進(jìn)行點(diǎn)樣 展開 定性 和定量的液 液分配色譜法 固定相 紙纖維吸附的水流動(dòng)相 與水不互溶的有機(jī)溶劑 飽和正丁醇 分離機(jī)制 同液 液分配色譜定性參數(shù) Rf Rf與組分性質(zhì) 流動(dòng)相及溶解度有關(guān)極性組分 易保留 Rf小 流動(dòng)相極性 Rf 非極性組分 易流出 Rf大 流動(dòng)相極性 Rf 21 高效液相色譜知識(shí) 22 經(jīng)典LC與HPLC比較 HPLC特點(diǎn) 高壓 高速 高效 高靈敏度 樣品回收方便 HPLC 采用高壓輸液泵 高效微粒固定相和高靈敏度檢測(cè)器 23 GC與HPLC比較 分析對(duì)象 高沸點(diǎn) 不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物 生物大分子 高分子化合物 24 高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相 固定相高效液相色譜固定相依據(jù)承受高壓能力來分類 可分為剛性固體和硬膠兩大類 剛性固體以二氧化硅為基質(zhì) 可承受7 O 108 1 O 109Pa的高壓 可制成直徑 形狀 孔隙度不同的顆粒 如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán) 就是鍵合固定相 是目前最廣泛使用的一種固定相 硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中 它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成 可承受壓力上限為3 5 108Pa 固定相按孔隙深度分類 可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類 25 1 表面多孔型固定相 基體是實(shí)心玻璃珠 在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料 如硅膠 氧化鋁 離子交換劑 分子篩 聚酰胺等 表面活性材料為硅膠的固定相如國外的Zpax CorasilI和II Vydac Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠等 表面活性材料為氧化鋁的固定相 如Pellumina 為聚酰胺的 如Pellion 特點(diǎn) 多孔層厚度小 孔淺 相對(duì)死體積小 出峰迅速 柱效亦高 顆粒較大 滲透性好 裝柱容易 梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡 較適合做常規(guī)分析 由于多孔層厚度薄 最大允許量受限制 26 2 全多孔型固定相 由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成 如國外的Porasil Zobbex Lichrosorb系列 上海試劑一廠的堆積硅珠 青島海洋化工廠的YWG系列 天津試劑二廠的DG系列等 由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相 如國外的LichrosorbALOXT 特點(diǎn) 顆粒很細(xì) 5 10 m 孔仍然較淺 傳質(zhì)速率快 易實(shí)現(xiàn)高效 高速 特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析 27 28 二 流動(dòng)相 高效液相色譜中流動(dòng)相是液體 它對(duì)組分有親和力 并參與固定相對(duì)組分的競爭 對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是 1 溶劑對(duì)于待測(cè)樣品 須具有合適的極性和好的選擇性 2 溶劑要與檢測(cè)器匹配 對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器 應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長比溶劑的紫外截止波長要長 所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí) 溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收 此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的 它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量 表20 2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長 對(duì)于折光率檢測(cè)器 要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相 以達(dá)最高靈敏度 29 30 3 高純度 由于高效液相靈敏度高 對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高 不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn) 或產(chǎn)生 偽峰 痕量雜質(zhì)的存在 將使截止波長值增加50 1OOnm 4 化學(xué)穩(wěn)定性好 不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑 5 低粘度 若使用高粘度溶劑 勢(shì)必增高壓力 不利于分離 常用的低粘度溶劑有丙酮 甲醇 乙腈等 但粘度過于低的溶劑也不宜采用 例戊烷 乙醚等 它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡 影響分離 31 高效液相色譜法分類及分離機(jī)理 分配色譜 樣品組分在吸附于惰性載體上的固定液和流動(dòng)相之間分配系數(shù)不同鍵合相色譜 樣品組分在鍵合于惰性載體上的固定液和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同吸附色譜 樣品組分對(duì)固定相表面吸附力不同體積排阻色譜 利用固定相孔徑不同 把樣品組分按分子大小分開離子交換色譜 不同離子與固定相上相反電荷間的作用力大小不同親和色譜 利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力 進(jìn)行選擇性分離的一種方法 32 一 分配色譜 partitionchromatography 原理 固定液吸附在惰性載體上 樣品分子依據(jù)他們?cè)诹鲃?dòng)相和固定相間的溶解度不同 分別進(jìn)入兩相分配而實(shí)現(xiàn)分離 適用于各種樣品類型的分離和分析 無論是極性的和非極性的 水溶性和油溶性的 離子型的和非離子型的化合物 固定相 將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上 由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競爭 因此 對(duì)固定相選擇較簡單 只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問題 例如 最常用的強(qiáng)極性固定液 一氧二丙睛 中等極性的聚乙二醇 非極性的角鯊?fù)榈?33 流動(dòng)相在液液色譜中為了避免固定液的流失 對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶 而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好 根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度 將其分為正相分配色譜和反相分配色譜 如果采用流動(dòng)相的極性小于固定相的極性 稱為正相分配色譜 它適用于極性化合物的分離 其流出順序是極性小的先流出 極性大的后流出 如果采用流動(dòng)相的極性大于固定相的極性 稱為反相分配色譜 它適用于非極性化合物的分離 其流出順序與正相色譜恰好相反 34 反相色譜最常用的流動(dòng)相 水 甲醇 乙腈 四氫呋喃 異丙醇等 水 甲醇體系 大約60 水的時(shí)候粘度最大水 乙腈體系 35 水的時(shí)候粘度最大 35 二 鍵合相色譜 Covalent stationaryphasechromatography 為了更好解決固定液在載體上流失問題 產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相 將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法 它代替了固定液的機(jī)械涂漬 因此對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用 可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破 目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相 約有3 4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的 鍵合固定相優(yōu)點(diǎn) 對(duì)極性有機(jī)溶劑有良好的化學(xué)穩(wěn)定性 使色譜柱的柱效高 壽命長 實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好 幾乎適于各種有機(jī)化合物的分離 可以梯度洗脫 缺點(diǎn)是不能用于酸 堿度過大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系 36 1 鍵合固定相類型用來制備鍵合固定相的載體 幾乎都用硅膠 利用硅膠表面的硅醇基 Si一OH 反應(yīng)成鍵 可得到各種性能的固定相 一般可分三類 1 疏水基團(tuán)如不同鏈長的烷烴 C8和C18 和苯基等 2 極性基團(tuán)如氨丙基 氰乙基 醚和醇等 3 離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基 季銨鹽 作為陽離子交換基團(tuán)的磺酸等 37 2 鍵合固定相的制備 l 硅酸酯 Si一OR 鍵合固定相 它是最先用于液相色譜的鍵合固定相 用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng) Si 0H ROH Si OR H20由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體 具有良好的傳質(zhì)特性 但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定 因此僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相 2 Si C或Si一N共價(jià)鍵合固定相制備反應(yīng)如下 38 共價(jià)鍵鍵合固定相不易水解 并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好 缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便 當(dāng)使用水溶液時(shí) 必須限制pH在4 8范圍內(nèi) 39 3 硅烷化 Si O Si C 鍵合固定相制備反應(yīng)如下 這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好 不易吸水 耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn) 能在70 以下 pH 2 8范圍內(nèi)正常工作 應(yīng)用較廣泛 40 3 反相鍵合相色譜法 反相鍵合相色譜 固定相極性 流動(dòng)相極性固定相 烷基 苯基等非極性有機(jī)分子 如最常用的ODS柱或C18柱就是最典型的代表 其極性很小 流動(dòng)相 極性較強(qiáng)的溶劑 如甲醇一水 乙腈一水 水和無機(jī)鹽的緩沖溶液等 適于分離非極性 弱極性離子型樣品 是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式 若采用水和無機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相 則可分離一些易離解的樣品 如有機(jī)酸 有機(jī)堿 酚類等 反相鍵合相色譜法具有柱效高 能獲得無拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn) 41 4 正相鍵合相色譜法 正相鍵合相色譜 固定相極性 流動(dòng)相極性固定相 二醇基 醚基 氰基 氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子 流動(dòng)相 非極性或極性小的溶劑 如烴類 中加入適量的極性溶劑 如醇 適合分離脂溶 水溶性的極性 強(qiáng)極性化合物 主要用于分離異構(gòu)體 極性不同的化合物 特別適用于分離不同類型的化合物 42 5 離子性鍵合相色譜法 固定相 以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì) 化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán) 如一SO3H一CH2NH2 C00H 一CH2N CH3 2等時(shí) 就形成了離子性鍵合相色譜的固定相 流動(dòng)相 一般采用緩沖溶液 其分離原理與離子交換色譜類同 43 44 三 液一固吸附色譜法 LSAC 分離原理 固定相是固體吸附劑 吸附劑是多孔性微粒物質(zhì) 表面有吸附中心 樣品組分與流動(dòng)相競爭吸附中心 各組分的吸附能力不同 使組分在固定相中產(chǎn)生保留時(shí)間不同而實(shí)現(xiàn)分離 當(dāng)流動(dòng)相通過固定相 吸附劑 時(shí) 吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子 同時(shí) 當(dāng)試樣分子 X 被流動(dòng)相帶入柱內(nèi) 只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分子 在固定相表面發(fā)生競爭吸附 X nSad Xad nS 45 達(dá)平衡時(shí) 有 其中Kad為吸附平衡常數(shù) 值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng) 難于洗脫 Kad值小 則保留值弱 易于洗脫 試樣中各組分據(jù)此得以分離 46 固定相 通常是強(qiáng)極性的硅膠 氧化鋁 活性炭 聚乙烯 聚酰胺等固體吸附劑 活性硅膠最常用 流動(dòng)相 弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物 如正構(gòu)烷烴 己烷 戊烷 庚烷等 二氯甲烷 甲醇 乙酸乙酯 乙腈等 應(yīng)用 對(duì)于極性 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法 如農(nóng)藥異構(gòu)體分離 石油中烷 烯 芳烴的分離 缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生不對(duì)稱峰和拖尾現(xiàn)象 47 極性吸附劑上有機(jī)化合物的保留順序如下 氟碳化合物 飽和烴 烯烴 芳烴 有機(jī)鹵化物 醚 硝基化合物 腈 叔胺 酯醛酮 醇 伯胺 酰胺 羧酸 磺酸 48 正相HPLC normalphaseHPLC 由極性固定相和非極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系 其代表性的固定相是改性硅膠 氰基柱等 代表性的流動(dòng)相是正己烷 吸附色譜也屬正相HPLC 反相HPLC reversedphaseHPLC 由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系 與正相HPLC體系正好相反 其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠 ODS柱 OctaDecyltrichloroSilane 代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈 49 四 體積排阻色譜 SEC sizeexclusionchromatography 排阻色譜法又稱凝膠色譜法 主要用于較大分子的分離 與其他液相色譜方法原理不同 它不具有吸附 分配和離子交換作用機(jī)理 而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的 排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí) 即用來分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布 特點(diǎn) 1 保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù) 有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息 2 保留時(shí)間短 譜峰窄 易檢測(cè) 可采用靈敏度較低的檢測(cè)器 3 固定相與分子間作用力極弱 趨于零 由于柱子不能很強(qiáng)保留分子 因此柱壽命長 4 不能分辨分子大小相近的化合物 相對(duì)分子質(zhì)量差別必須大于10 才能得以分離 50 原理 以多孔凝膠 如葡萄糖 瓊脂糖 硅膠 聚丙烯酰胺等 作固定相 依據(jù)樣品分子量大小達(dá)到分離目的 大分子不進(jìn)入凝膠孔洞 沿多孔凝膠膠粒間隙流出 先被洗脫 小分子進(jìn)入大部分凝膠孔洞 在柱中被強(qiáng)滯留 后被洗脫 根據(jù)樣品性質(zhì)分類 凝膠過濾 GFC 用于分析水溶性樣品 如多肽 蛋白 生物酶 寡聚核苷酸 多聚核酸 多糖 凝膠滲透 GPC 用于分析脂溶性樣品 如測(cè)定高聚物的分子量 SEC主要依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離 因此與樣品 流動(dòng)相間的相互作用無關(guān) 不采用改變流動(dòng)相的組成來改善分離度 51 固定相排阻色譜固定相種類很多 一般可分為軟性 半剛性和剛性凝膠三類 所謂凝膠 指含有大量液體 一般是水 的柔軟而富于彈性的物質(zhì) 它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體 1 軟性凝膠如葡聚糖凝膠 瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu) 其微孔能吸入大量的溶劑 并能溶脹到它們干體的許多倍 它們適用以水溶性溶劑作流動(dòng)相 一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析 不適宜用在高效液相色譜中 2 半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯 Styragel 比軟性凝膠稍耐壓 溶脹性不如軟性凝膠 常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相 用于高效液相色譜時(shí) 流速不宜大 3 剛性凝膠如多孔硅膠 多孔玻璃等它們既可用水溶性溶劑 又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相 可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作 一般控制壓強(qiáng)小于7MPa 流速 1cm3 s 1 否則將影響凝膠孔徑 造成不良分離 52 流動(dòng)相1 排阻色譜所選用的流動(dòng)相必須能溶解樣品 2 與凝膠本身非常相似 這樣才能潤濕凝膠 當(dāng)采用軟性凝膠時(shí) 溶劑也必須能溶脹凝膠 3 溶劑的粘度要小 因?yàn)楦哒扯热軇┩拗品肿訑U(kuò)散作用而影響分離效果 這對(duì)于具有低擴(kuò)散系數(shù)的大分子物質(zhì)分離 尤需注意 4 選擇溶劑還必須與檢測(cè)器相匹配 常用的流動(dòng)相有四氫呋喃 甲苯 氯仿 二甲基酸胺和水等 以水溶液為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于水溶性樣品 以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品 53 五 離子交換色譜 ionexchangechromatography IEC 利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法 凡在溶液中能夠電離的物質(zhì) 通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離 不僅適用無機(jī)離子混合物的分離 亦可用于有機(jī)物的分離 例如氨基酸 核酸 蛋白質(zhì)等生物大分子 54 分離原理 使用表面有離子交換基團(tuán)的離子交換劑作為固定相 帶負(fù)電荷的交換基團(tuán) 如磺酸基和羧酸基 可以用于陽離子的分離 帶正電荷的交換基團(tuán) 如季胺鹽 可以用于陰離子的分離 不同離子與交換基的作用力大小不同 在樹脂中的保留時(shí)間長短不同 從而被相互分離 55 1 離子交換原理離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的 其固定相采用離子交換樹脂 樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子 當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換 其交換反應(yīng)通式如下 陽離子交換 陰離子交換 56 達(dá)平衡時(shí) 以濃度表示的平衡常數(shù) 離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù) 式中 A r B r分別代表樹脂相中洗脫劑離子 A 和試樣離子 B 的濃度 A B 則代表它們?cè)谌芤褐械臐舛?KB A越大 說明B離子交換能力越大 越易保留而難于洗脫 一般形式 R一A B R B A 57 對(duì)于典型的磺酸型陽離子交換樹脂 一價(jià)離子的KB A值按以下順序 Cs Rb K NH4 Na H Li 二價(jià)離子的順序?yàn)?Ba2 Pb2 Sr2 Ca2 Cd2 Cu2 Zn2 Mg2 對(duì)于季銨型強(qiáng)陰離子交換樹指 各陰離子的選擇性順序?yàn)?ClO4 I HS04 SCN NO2 Br CN Cl BrO3 OH HCO3 H2P04 IO3 CH3COO F 58 2 固定相作為固定相的離子交換劑 其基質(zhì)大致有三大類 合成樹脂 聚苯乙烯 纖維素和硅膠 而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分 再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分 59 分類按離子交換劑類型 強(qiáng)陽離子交換劑以磺酸基為代表 SO3 強(qiáng)陰離子交換劑以季胺基為代表 NR3 弱陽離子交換劑以羧酸基為代表 COO 弱陰離子交換劑以二乙基氨基為代表 CH2N C2H5 2H 60 按固定相制作方法 多孔型離子交換樹脂薄膜型離子交換樹脂表面多孔型離子交換樹脂離子交換鍵合固定相 61 l 多孔型離子交換樹脂主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物 直徑約為5 20 m 有微孔型和大孔型之分 2 薄膜型離子交換樹脂是在直徑約30 m的固體惰性核上 凝聚1 2 m厚的樹脂層 3 表面多孔型離子交換樹脂是在固體惰性核上 覆蓋一層微球硅膠 再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂 4 離子交換鍵合固定相是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面 分為兩種類型 一種是鍵合薄殼型 其載體是薄殼玻珠 另一種是鍵合微粒載體型 它的載體是多孔微粒硅膠 后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相 它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定 可使用小粒度固定相和高柱壓來實(shí)現(xiàn)快速分離 62 流動(dòng)相 1 離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度 或離子強(qiáng)度 的緩沖溶液 2 通過改變流動(dòng)相中鹽離子的種類 濃度和pH值改變選擇性 如果增加鹽離子的濃度 則可降低樣品離子的競爭吸附能力 從而降低其在固定相上的保留值 一般 對(duì)于陰離子交換樹脂來說 各種陰離子的滯留次序?yàn)?檸檬酸離子 SO42 C2O42 I NO3 CrO42 Br SCN Cl HCOO CH3C00 OH F 所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快 陽離子的滯留次序大為 Ba2 Pb2 Ca2 Ni2 Cd2 Cu2 Co2 Zn2 Mg Ag Cs Rb K NH4 Na H Li十差別不如陰離子明顯 3 關(guān)于pH值的影響 要視不同情況而定 例如 分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí) 這些酸堿的離解程度可通過改變流動(dòng)相的pH值來控制 增大pH值會(huì)使酸的電離度增加 使堿的電離度減少 降低pH值 其結(jié)果相反 但無論屬于哪種情況 只要電離度增大 就會(huì)使樣品的保留增大 63 六 親和色譜法 AC 1 親和色譜是利用生物大分子和固定相表面存在某種特異性親和力 進(jìn)行選擇性分離的一種方法 2 通常是在載體 無機(jī)或有機(jī)填料 表面先鍵合一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂 如環(huán)氧 聯(lián)氨等 隨后 再連接上配基 酶 抗原或激素等 3 固載化的配基只能和具有親和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留 沒有這種作用的分子不被保留 圖20 9為親和色譜法示意圖 64 固定相 載體和配基載體 具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 具有相當(dāng)數(shù)量可供耦聯(lián)的基團(tuán) 能結(jié)合配基 無吸附性 均一 有一定硬度 性質(zhì)穩(wěn)定 常用的有瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 葡聚糖凝膠 多孔玻璃配基 對(duì)親和物有專一的親和力 有能與載體相連的基團(tuán) 如腺嘌呤核苷酸吸附劑 核苷酸吸附劑等流動(dòng)相 緩沖溶液應(yīng)用 生物大分子分離和分析 65 分離類型的選擇 1 根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品 其揮發(fā)性好 適用于氣相色譜 標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型 液一固 液一液 及離子交換色譜 最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是20O 2000 對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品 則用排阻法為最佳 2 根據(jù)溶解度選擇弄清樣品在水 異辛烷 苯 四氯化碳 異丙醇中的溶解度是很有用的 如果樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì) 以采用離子交換色譜為佳 如樣品可溶于烴類 如苯或異辛烷 則可采用液一固吸 66 附色譜 如樣品溶解于四氯化碳 則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離 如樣品既溶于水又溶于異丙醇時(shí) 常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動(dòng)相 以憎水性化合物作固定相 3 根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇用紅外光譜法 可預(yù)先簡單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán) 然后 確定采用什么方法合適 例如 酸 堿化合物用離子交換色譜 脂肪族或芳香族用液一液分配色譜 液一固吸附色譜 異構(gòu)體用液一固吸附色譜 同系物或不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液一液分配色譜 現(xiàn)列表作為選擇分離類型的參考 67 液相色譜分離類型選擇參考表溶于水 排阻色譜 水為流動(dòng)相相對(duì)分子質(zhì)量 2000不溶于水 排阻色譜 非水流動(dòng)相同系物 分配色譜不溶于水異構(gòu)體 吸附色譜樣品分子大小差異 排阻色譜反相液一液色譜相對(duì)分子質(zhì)量溶于水 不離解 2000排阻色譜 水為流動(dòng)相堿 陽離子交換色譜溶于水 可離解酸 陰離子交換色譜 68 HPLC儀器 HPLC儀器 1 流動(dòng)相系統(tǒng) 4 其他輔助系統(tǒng) 2 分離系統(tǒng) 3 檢測(cè)系統(tǒng) 69 Agilent1100系列高效液相色譜系統(tǒng) 70 儲(chǔ)液槽 71 貯液槽貯液槽材料 應(yīng)當(dāng)耐腐蝕 可為玻璃 不銹鋼 氟塑料或特種塑料聚醚酮 PEEK 貯液槽容積 0 5 2 0L 要求 1 貯液槽放置位置要高于泵體 以保持一定的輸液靜壓 2 貯液槽在使用中應(yīng)密閉 以防溶劑蒸發(fā)引起流動(dòng)相組成的變化 并可防止空氣中的CO2 O2重新溶解于脫氣的流動(dòng)相中 72 采用 HPLC 級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配 流動(dòng)相的選擇 73 溶劑前處理 過濾 0 45um或更小孔徑濾膜目的 除去溶劑中的微小顆粒 避免堵塞色譜柱 尤其在使用無機(jī)鹽配制的緩沖液時(shí)脫氣目的 除去流動(dòng)相中因溶解或混合而產(chǎn)生的氣泡 74 脫氣裝置 氦氣脫氣法 在線脫氣法 75 脫氣 吹氦氣脫氣法適于給所有溶劑脫氣 脫氣效率高 但價(jià)格昂貴 如上圖 左圖 加熱回流法 抽真空脫氣法外接真空泵 對(duì)溶劑抽真空 由于抽真空會(huì)引起溶劑組成的改變 故不適于混合溶劑 因此要對(duì)每種溶劑預(yù)先脫氣后再進(jìn)行混合 超聲波脫氣法將溶劑倒入超聲波清洗器中 用超聲波震蕩趕走氣泡 脫氣效果最差 以上方法均為離線脫氣 隨溶劑存放時(shí)間延長又會(huì)有空氣進(jìn)入溶劑 在線真空脫氣法將真空脫氣裝置串接到貯液罐于高壓泵之間 實(shí)現(xiàn)溶劑在進(jìn)入高壓泵之前的連續(xù)脫氣 脫氣效果最優(yōu) 如上圖 右圖 76 高壓輸液泵 恒流泵 77 高壓輸液泵在高效液相色譜分析中 色譜柱裝填5 10 m的固定相 對(duì)流動(dòng)相的通過有很大的阻力 高壓輸液泵的作用就是用較高的壓力推動(dòng)流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱 高壓輸液泵分兩類 恒流泵恒壓泵恒流泵可輸出恒定體積流量的流動(dòng)相 1 單柱塞注射型泵 2 雙柱塞往復(fù)型并聯(lián)泵恒壓泵 是輸出恒定壓力的泵 以壓縮空氣為驅(qū)動(dòng)力 高壓推動(dòng)活塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)完成流動(dòng)相的吸入和輸出 以改變氣體壓力調(diào)節(jié)載液流速 78 等度洗脫 79 梯度洗脫 80 分析時(shí)間長 分離度差 MeOH H2O 6 4 MeOH H2O 8 2 column ODStype 等度洗脫 81 95 30 甲醇濃度 梯度洗脫 82 混合器 低壓梯度比例閥 高壓梯度 低壓梯度 脫氣機(jī) 高壓 低壓梯度系統(tǒng) 83 高壓梯度系統(tǒng)梯度準(zhǔn)確度好系統(tǒng)復(fù)雜 需兩臺(tái)或三臺(tái)泵 低壓梯度系統(tǒng)系統(tǒng)簡單需在線脫氣機(jī)存在時(shí)間滯后效應(yīng) 高壓 低壓梯度系統(tǒng) 84 Agilent四元梯度泵 85 進(jìn)樣器 手動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器 86 手動(dòng)進(jìn)樣器的原理圖 裝填狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài) 87 部分注