同步熒光光譜法ppt課件

.,4-3同步熒光光譜法(SynchronousFluorescence),.,一、同步熒光分析原理,同步熒光技術(shù)是同時(shí)掃描激發(fā)單色器和發(fā)射單色器波長(zhǎng)的情況下來測(cè)繪熒光光譜圖。由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)對(duì)發(fā)射或激發(fā)波長(zhǎng)作圖，稱為同步熒光光譜。,.,SYNCHR.EX.SCAN,NOR.EM.SCAN,NOR.EX.SAN,NOFLUORE,SCATTERLINE,/nm,nm,.,1、固定波長(zhǎng)的同步熒光光譜(Constantwavelengthsynchronousluminescence,CWSL),(1)在同步掃描中，使激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)保持固定的波長(zhǎng)間距，即常數(shù)。將同步熒光信號(hào)對(duì)發(fā)射或激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)繪熒光光譜圖，則為固定波長(zhǎng)的同步熒光光譜。,.,（2）定量依據(jù),激發(fā)光譜強(qiáng)度分布,發(fā)射光譜強(qiáng)度分布,（2）同步掃描激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)的發(fā)射光譜,（3）同步掃描發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)的激發(fā)光譜,（2）,（3）,（1）,.,（3）同步熒光光譜的特點(diǎn),a.同步光譜與激發(fā)光譜及發(fā)射光譜都有關(guān)系。它同時(shí)利用了化合物的吸收特性和發(fā)射特性，因而使光譜分析的選擇性得到改善。b.有利于多組分混合物的分析。同步熒光光譜可以把強(qiáng)帶增強(qiáng)而減小弱帶的干擾。c.可消除Raylei干擾，使Roman強(qiáng)度降低且拉寬。,.,（4）的選擇,只有當(dāng)恰好相當(dāng)于某吸收帶和其發(fā)射帶之間波長(zhǎng)間距時(shí)，才能觀察到同步信號(hào)。,=斯托克斯位移（發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)之差),與狹縫寬度d的大致原則：,只受瑞利：,當(dāng)同時(shí)受瑞利和拉曼散射干擾,測(cè)定波,拉曼散射光的波長(zhǎng),.,2、固定能量的同步熒光光譜constantenergysynchronousluminescence(CESL),固定能量的同步熒光光譜，是指在同步掃描過程中，使激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)之間保持著固定的能量差。,Ray,Roman,.,常數(shù),表示波數(shù)差,與成正比,拉曼光與入射光之間的頻率差稱為拉曼位移,.,當(dāng),或,時(shí),固定能量的同步熒光光譜可消除瑞利散射和拉曼散射，而固定波長(zhǎng)的同步熒光光譜只能消除瑞利散射，使拉曼散射拉寬。二者皆能降低光譜的復(fù)雜性，提高選擇性。,F,.,二、同步掃描儀器設(shè)備,1、固定波長(zhǎng)的熒光光譜的獲得,對(duì)于以光柵為單色器的熒光分光光度計(jì)，只要分別設(shè)置激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器所需的起始波長(zhǎng)，并使它們以同樣的速率進(jìn)行掃描，便可進(jìn)行固定波長(zhǎng)同步掃描熒光測(cè)定。,2、固定能量同步掃描是非線性的可變角同步掃描，需通過微處理機(jī)控制而加以實(shí)現(xiàn)。,.,三、應(yīng)用,1、在多環(huán)芳烴分析中的應(yīng)用減小光譜的重疊,（1）固定波長(zhǎng)同步熒光法用于煤中多環(huán)芳烴的測(cè)定苊(Ace)，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)，苯并芘(Bap)，苝(Per)用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算2,3-苯并芴,（2）低溫固定能量同步熒光法,.,煤液化樣品中各種有機(jī)物的同步熒光光譜,煤液化樣品的固定波長(zhǎng)同步熒光光譜,.,2、同步熒光法在醫(yī)藥檢驗(yàn)方面的應(yīng)用,（1）違禁藥品中苯丙胺和嗎啡加奎寧麥角酸二乙酰胺的測(cè)定（2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽,.,（3）酪氨酸和色氨酸嚴(yán)重重疊,CWSL,的同步熒光色氨酸的光譜特征,的同步熒光酪氨酸的光譜特征,or70nm的二階導(dǎo)數(shù)同步熒光可對(duì)Trp和Tyr分辨,同步熒光可對(duì)Trp、Tyr、Phe分辨,.,（4）維生素B1、B2混合物中維生素B1的測(cè)定用鐵氰化鉀將B1氧化硫胺熒（5）尿液中腎上腺素和去甲腎上腺素的同時(shí)測(cè)定,.,總結(jié)：,.,4-4時(shí)間分辨熒光法（TimeDomainFluorometry）(TimeResolvedFluorometry）,.,一、時(shí)間分辨法原理用短脈沖光源激發(fā)的熒光體群體，隨時(shí)間而衰變，其衰變率為,受激分子的壽命,.,用F(t)或N(t)對(duì)t作圖,1/e,F(t)orN(t),t,or,t,熒光壽命為熒光強(qiáng)度衰變到初始值的1/e所需要的時(shí)間。,.,特點(diǎn)：采用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光源和檢測(cè)體系，可以得到在固定波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度時(shí)間曲線和在固定時(shí)間的熒光發(fā)射光譜。（1）可以對(duì)混合物中光譜重疊但壽命差異的組分進(jìn)行分辨；（2）可消除雜質(zhì)與背景熒光；（3）可測(cè)量溶劑松弛的時(shí)間。,.,二、時(shí)間分辨儀器設(shè)備,激發(fā)光源、時(shí)間延遲設(shè)備、激發(fā)單色器、樣品池、熒光單色器及設(shè)有門控的檢測(cè)器,1、激發(fā)光源短脈沖的激發(fā)光源,閃光燈,氮閃光燈幾條高強(qiáng)度射線,氫閃光燈,氘閃光燈,連續(xù)線強(qiáng)度低,.,激光器,氮分子激光器337.1nm,氬離子激光器351nm,染料激光器所需波長(zhǎng),光子通量大、峰值功率高、單色性好、發(fā)生的光脈沖持續(xù)時(shí)間短，激光熒光法具有較高的靈敏度和選擇性。,.,2、檢測(cè)器如光電倍增管帶有門控的,.,三、時(shí)間分辨熒光的分析應(yīng)用,熒光體的熒光壽命的測(cè)定時(shí)間分辨熒光光譜熒光發(fā)射的衰變曲線,.,1、熒光體混合物中兩組分的同時(shí)測(cè)定,例用8-羥基喹啉-5-磺酸(R)同時(shí)測(cè)定Al和Ga15.20ml樣品+1ml0.045%R+2ml20%NH4Ac(or20%NH4Cl)調(diào)pH至4.5，稀釋至25ml氘燈激發(fā)測(cè)定熒光強(qiáng)度時(shí)間曲線,.,（1）測(cè)定熒光衰變曲線,AlRGaR,可利用上述兩個(gè)熒光化合物的差異對(duì)它們進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。,.,（2）計(jì)算含量,鋁配合物和鎵配合物的衰變曲線,鋁配合物和鎵配合物的對(duì)數(shù)衰變曲線,比較（1）和（4）的熒光強(qiáng)度得Al的含量比較（2）和（5）的熒光強(qiáng)度得Ga的含量,.,2、芳基的測(cè)定例用ps雙色熒光法對(duì)鹵素芳族化合物光離解作用所產(chǎn)生的芳基進(jìn)行檢測(cè)（1）用25ps，266nm激光脈沖使1-(氯甲基)萘，1-(溴甲基)萘，2-(氯甲基)萘，2-(溴甲基)萘等化合物離解產(chǎn)生芳基。（2）在延遲60ps后，用25ps，355nm激光脈沖激發(fā)芳基的熒光，產(chǎn)生橙色熒光，600nm，10ns，如圖所示。,（a）和（c）一致，是1-萘甲基所致（b）和（d）一致，是2-萘甲基所致,.,3、溶劑松弛時(shí)間的分辨測(cè)量,許多分子在基態(tài)時(shí)具有從中等到大的偶極矩，在激發(fā)態(tài)時(shí)偶極矩發(fā)生變化，從而引起周圍溶劑分子中電子的重排和溶劑分子圍繞激發(fā)態(tài)溶質(zhì)分子偶極的重新定向，這個(gè)過程稱為溶劑松弛，這個(gè)過程所需的時(shí)間叫溶劑松弛時(shí)間。在松弛過程中，能量有所降低，因而發(fā)射向長(zhǎng)波位移。時(shí)間分辨熒光法可記錄不同時(shí)間的發(fā)射光譜，因而可測(cè)量松弛時(shí)間。,.,例14-氨基苯鄰二酰亞胺（4-AP）的丙醇溶液在不同的溫度下的時(shí)間分辨的熒光光譜圖,室溫下，-132熒光光譜與時(shí)間t無關(guān)在-77K，熒光光譜與t有關(guān)在4ns，溶劑還未重新取向在23ns，溶劑取向已完成,.,例22-對(duì)-苯甲基萘-6-磺酸鹽染料,溶劑甘油溫度A圖41.8ns,8.0ns,12.2nsB圖571.8ns,8.0ns,12.2ns,.,4-5相分辨熒光法（Frequency-DomainFluorometry/Phase-ModulationFluorometry),.,Theobjectiveofbothtime-domainandfrequency-domainfluorometryistorecovertheparameterdescribingthetime-resolveddecay.,.,一、相分辨法原理1、單指數(shù)衰變的熒光當(dāng)樣品被激發(fā)光激發(fā)而發(fā)射熒光時(shí)，如激發(fā)光的光強(qiáng)度被正弦調(diào)制，其角調(diào)制頻率為，則發(fā)射光也同樣被調(diào)制。由于吸收和發(fā)射之間的時(shí)間延遲，調(diào)制的發(fā)射光比起激發(fā)光在相上延遲了角。但發(fā)射光的調(diào)制比起激發(fā)光的調(diào)制小一些，也即是發(fā)射光的改變部分的相對(duì)幅度比起激發(fā)光要小些。,.,去調(diào)制因素,激發(fā)光和發(fā)射光的光強(qiáng)正弦調(diào)制,.,在測(cè)量相角（）或去調(diào)制因素（m）之后，可以計(jì)算該熒光體的熒光壽命。相分辨法是熒光壽命的測(cè)量方法之一。,.,m,10MHz,30MHz,10MHz,30MHz,、m與的關(guān)系如下：,.,m隨的增大而下降m=1發(fā)射光與激發(fā)光的調(diào)制幅度相同m越小發(fā)射光被調(diào)制的幅度越小,隨的增大而增大，壽命越長(zhǎng)，延遲的越大。當(dāng)熒光分子的壽命越長(zhǎng)，發(fā)射相對(duì)于激發(fā)延遲的時(shí)間就越長(zhǎng)。,.,2、多指數(shù)衰變的熒光如果樣品中含有兩種熒光體，或者單一熒光體而進(jìn)行進(jìn)一步激發(fā)態(tài)反應(yīng)，則熒光是雙指數(shù)衰變。如果進(jìn)行多步反應(yīng)，則熒光是多指數(shù)衰變。,由和m所計(jì)算的是表觀熒光壽命。如采用相靈敏檢測(cè)器的相熒光計(jì)，,激發(fā)光的調(diào)制度（或振幅）,去調(diào)制因素,單一熒光體,.,對(duì)于相靈敏檢測(cè)器,穩(wěn)態(tài)熒光光譜,檢測(cè)角度,在不同相角測(cè)定熒光光譜，稱為相靈敏熒光光譜，即為在固定時(shí)間的熒光光譜。,.,若樣品溶液中含有A、B兩種熒光體，它們的熒光壽命分別為A和B。,如,，則該組分的發(fā)射被抑制,.,要得到混合物中組分A的穩(wěn)態(tài)光譜，須把檢測(cè)器相角調(diào)節(jié)至和組分B正交。這是很費(fèi)時(shí)的，最好得到另外的信息:先得到任何一組分的穩(wěn)態(tài)熒光光譜，然后調(diào)節(jié)檢測(cè)器相角至該熒光光譜和混合物的熒光光譜重疊，則可得到與另一組分正交的相角。使用任何一組分的純?nèi)芤阂源_定檢測(cè)器的相角。,.,當(dāng)用相靈敏檢測(cè)器在各種不同檢測(cè)器相角測(cè)繪樣品的相靈敏熒光光譜。對(duì)于單一化合物，其熒光峰波長(zhǎng)基本上保持不變而與檢測(cè)器相角無關(guān)。如果不是均勻的發(fā)射，則熒光峰隨著檢測(cè)器相角而改變，在不同檢測(cè)器相角得到的相靈敏光譜是鑒別不均勻發(fā)射的有力工具。,.,3、相分辨熒光法與時(shí)間分辨熒光法比較用于熒光參數(shù)測(cè)量的儀器可分為兩大類,穩(wěn)態(tài)測(cè)量steady-state時(shí)間依賴的測(cè)量timedependent,相分辨熒光法與時(shí)間分辨熒光法本質(zhì)上都是時(shí)間依賴或時(shí)間分辨的測(cè)量。,.,（1）儀器時(shí)間分辨熒光法的局限性a.儀器常常非常復(fù)雜，常局限于有關(guān)專家使用；b.靈敏度常低于穩(wěn)態(tài)測(cè)量。相分辨法的優(yōu)點(diǎn)a.儀器類似于穩(wěn)態(tài)測(cè)量的儀器，使用簡(jiǎn)單；b.靈敏度高；c.數(shù)據(jù)處理快。,.,（2）測(cè)量參數(shù)a.F(t)-t曲線時(shí)間分辨b.m.相分辨,.,（3）從實(shí)驗(yàn)的觀點(diǎn)，相分辨有下列優(yōu)點(diǎn)：在時(shí)間分辨的方法中，測(cè)量的延遲信號(hào)的去卷積對(duì)于計(jì)算測(cè)量系統(tǒng)的限定時(shí)間的響應(yīng)是必要的，而相分辨法不受此限制；相分辨法允許不同方向的直接測(cè)量。如在各向異性的延遲測(cè)量中，平行和垂直偏振成份的和m的測(cè)定；相分辨法為基于熒光壽命差異的光譜成份之直接分辨提供了一種簡(jiǎn)單、有效的方法。,.,二、相分辨儀器設(shè)備,與一般熒光分光光度計(jì)大致相似，但增加了光調(diào)制器及測(cè)量相角和去調(diào)制因素的設(shè)備。,.,1、光調(diào)制器（1）Kerr調(diào)制器不能透射UV（2）Pockels調(diào)制器需要較低電壓，能透過紫外光，可在連續(xù)可變的頻率下操作，但要求高度準(zhǔn)直的光，適用于以激光器為光源的相分辨熒光計(jì)。（3）Dedye-Sears超聲波調(diào)制器能透過紫外光，對(duì)光準(zhǔn)直的要求不太高，可用于各種光源。,.,2、檢測(cè)系統(tǒng)由單色器，光電倍增管，鎖定放大器組成。鎖定放大器只檢測(cè)與參比信號(hào)相同頻率且具有一定位相關(guān)系的信號(hào)成份，從而大大提高了信噪比。,.,三、相分辨熒光的分析應(yīng)用,1、熒光體兩組分混和物中個(gè)別組分的熒光光譜的直接記錄和熒光壽命的測(cè)定2對(duì)甲苯氨基6萘磺酸（TNS）和6丙酰2（二甲基氨基）萘（PRODAN）混合物在乙醇溶液中,穩(wěn)態(tài)熒光光譜相靈敏熒光光譜調(diào)整D,PRODAN被抑制TNS的熒光光譜，=3.6ns,TNS被抑制PRODAN的熒光光譜，=11.6ns,當(dāng),當(dāng),.,TNS和PRODAN的穩(wěn)態(tài)熒光光譜,.,TNS-PRODAN混合物的相靈敏熒光光譜,.,從混合物直接記錄下的TNS和PRODAN的熒光光譜,.,2、溶劑松弛的相分辨在溶劑松弛過程中，一般情況能量有些降低，松弛態(tài)發(fā)射光譜紅移。但降低溫度會(huì)使光譜藍(lán)移。,N-乙酰基-L-色氨酸胺（NATA）solvent:丙稀甘油（1）不同T下的熒光光譜（2）相靈敏熒光光譜在固定D即t下所得到的熒光光譜,.,NATA在丙烯甘油中的熒光光譜,.,NATA在丙烯甘油中的相靈敏熒光光譜,.,4-6熒光動(dòng)力學(xué)分析法（FluorescentKineticAnalysis),.,一、動(dòng)力學(xué)法原理由于化學(xué)反應(yīng)的速率與反應(yīng)物的濃度有關(guān)，在某些情況下與催化劑的濃度有關(guān)，因此可以通過測(cè)量反應(yīng)的速率以確定待側(cè)物的含量。,光度法電位法熒光法,測(cè)速率,以熒光法監(jiān)測(cè)反應(yīng)速率，這種方法則稱為熒光動(dòng)力學(xué)分析法。,.,aA+bBnC+mD=kAaBba=1b=1=kAB,.,1、熒光動(dòng)力學(xué)分析的特點(diǎn)（1）優(yōu)點(diǎn)a.只觀測(cè)反應(yīng)初期的速率，可用于某些反應(yīng)速率慢、平衡常數(shù)小或可能發(fā)生副反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)；b.動(dòng)力學(xué)分析是一種相對(duì)測(cè)量,動(dòng)力學(xué)分析法有可能比平衡法具有更好的選擇性;c.靈敏度高、操作較快、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。,.,（2）局限性a.所使用反應(yīng)的半衰期應(yīng)在5ms到1h之間;b.必須嚴(yán)格地控制溫度、pH、試劑濃度、離子強(qiáng)度等反應(yīng)條件和其它可能影響反應(yīng)速率的因素；c.動(dòng)力學(xué)測(cè)量的信噪比在本質(zhì)上要比平衡法小,只有反應(yīng)的一小部分用于測(cè)定；d.試樣基質(zhì)的干擾問題仍可能發(fā)生,如降低有效濃度,與分析物結(jié)合。,.,2、熒光動(dòng)力學(xué)分析法,非催化法催化法酶催化法,（1）非催化法通過測(cè)量非催化反應(yīng)的速率而測(cè)定某種反應(yīng)物的濃度。,.,（2）催化法以催化反應(yīng)為基礎(chǔ)來測(cè)定物質(zhì)含量的方法。催化反應(yīng)速率與催化劑的濃度成正比，因此可測(cè)定催化劑的濃度，也可用于測(cè)定某些對(duì)催化反應(yīng)起助催作用或抑制作用的物質(zhì)。例:8-羥基喹啉-5-磺酸+過硫酸銨,Ag+,.,(3)酶催化法基于酶催化的反應(yīng)，這類反應(yīng)的突出優(yōu)點(diǎn)是它的特效性和高靈敏度,不僅可用來測(cè)定酶的活性,也可用來測(cè)定底物、活化劑和抑制劑.,.,3、反應(yīng)速率的熒光法監(jiān)測(cè)假如化學(xué)反應(yīng)的某種反應(yīng)物或產(chǎn)物是熒光物質(zhì),便可利用熒光法來監(jiān)測(cè)反應(yīng)的速率。記F-t曲線可通過正切法(斜率法)或固定時(shí)間法或固定熒光強(qiáng)度法獲得校正曲線。,.,（1）正切法從F-t曲線求反應(yīng)速率,然后用作圖,c,.,(2)固定時(shí)間法使反應(yīng)準(zhǔn)確地進(jìn)行到某一固定的時(shí)刻t，立即測(cè)定F,得到F-c曲線,c,F,.,(