生物素-親和素反應的放大技術ppt課件

生物素-親合素放大技術,第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質與標記一、理化特性二、親合素（或鏈酶親合素）的標記,第一節(jié)生物素的理化性質與標記一、活化生物素二、活化生物素標記蛋白質,第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的特點一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他,思考題小結,第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應用一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應用三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術中的應用四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應用五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學中的應用,生物素（biotin）、親和素（avidin）是一對具有高度親和力的物質，結合迅速、專一、穩(wěn)定并具有多級放大效應。,生物素（維生素H）動、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高分子量小，244.31D,I環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合素結合環(huán)為噻吩環(huán)，C2上戊酸側鏈的未端羧基是結合生物大分子的唯一結構,I咪唑酮環(huán),噻吩環(huán),羧基:可用于活化為其他衍生物,第一節(jié)生物素理化性質與標記,一、活化生物素,生物素側鏈的末端羧基經(jīng)化學修飾后制成帶各種活性基團的衍生物活化生物素(生物素化衍生物)為何要活化？,活化生物素,活化生物素易與抗原、抗體、酶及核酸分子中相應基團偶聯(lián)形成生物素化標記物,標記蛋白質氨基的活化生物素,標記蛋白質醛基的活化生物素,標記蛋白質巰基的活化生物素,標記核酸的活化生物素,活化生物素,標記蛋白質氨基的活化生物素,BNHS分子可與蛋白質賴氨酸（堿性AA）的氨基形成肽鍵BNHS適用標記抗體和中性或偏堿性的蛋白質,生物素,N-羥基丁二酰胺,碳二亞胺,生物素羥基琥珀酰亞胺酯(BNHS),如何減小空間位阻,長臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個6-氨基已糖分子基團，形成連結臂，生物素與大分子基團的距離增加，更易發(fā)揮生物素的活性作用。,生物素分子量小，當與抗體或酶形成生物素標記結合物后，由于大分子蛋白的空間位阻效應，可對生物素與親和素的結合以及BAS的應用效果造成干擾。,？,標記蛋白質醛基的活化生物素,生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素與賴氨酸連接后，再與無水肼反應而成。除醛基外，BCHZ還可標記氨基,標記蛋白質巰基的活化生物素,馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特異地與蛋白質巰基結合的活化生物素,標記核酸的活化生物素,光生物素(photobiotin)光敏物質側鏈上連接的芳香基疊氮物基團,經(jīng)光照后,變?yōu)榉枷慊趸?，可直接與腺嘌呤氨基結合,形成B-核酸探針，用于DNA或RNA的標記。生物素脫氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP）作為TTP的結構類似物，可采用缺口移位法（DNaseI和DNA聚合酶I）摻入到雙鏈DNA中。BNHS和BHZ可直接標記核酸，但對堿基配對有影響。,目前常用光生物素和生物素化dUTP作為標記核酸的活化生物素。,特性：活化生物素通過側鏈與蛋白分子連接；一個蛋白分子可被多個生物素標記多價性（是BAS多級放大作用的物質基礎）；BNHS多標記抗體和中性或偏堿性的蛋白質,BHZ則多標記微酸性抗原；抗原、抗體標記后活性不變；可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后，活性降低；,二、活化生物素標記蛋白質,注意事項：選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記基團的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1,IgG應用濃度0.55g/ml;生物素13個/Ag，35個/Ab；使用交聯(lián)臂減少空間阻力,第二節(jié)親合素、鏈霉親合素的理化性質與標記,親合素(avidin,AV)和鏈霉親合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特異性結合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標記的物質均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結合。,結構四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無糖基PI10.56結合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性1315U1518U,親合素（AV）,鏈霉親合素(SA),一、理化特性,SA表面所帶正電荷少，且不含糖基，非特異性結合遠低于AV，因此目前以SA標記的酶結合物更為常用。,二、親合素/鏈霉親合素的標記,可標記AV/SA的物質：酶、抗原或抗體、鐵蛋白、膠體金、125I、異硫氰酸熒光素（FITC）等。HRP-AV(SA)（酶標記蛋白的直接標記法）：過碘酸鈉法、戊二醛法。ABC/SABC：通過與生物素化酶復合物中的生物素結合，間接地與酶形成結合物。AV(SA)+B-HRP/ALPABC(avidin-biotin-peroxidasecomlplex)/ABAP,第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點,靈敏度高:生物素標記蛋白具有多價性，且標記后的抗原/抗體生物活性不變，每個親合素有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合到生物素化大分子衍生物和標志物上，因此，BAS具有多級放大作用，反應的靈敏度高。穩(wěn)定性高和特異性強：AV/SA與生物素結合的親和常數(shù)比抗原-抗體反應至少高1萬倍，二者的結合呈高度專一性和不可逆性，且酸、堿、變性劑、蛋白溶解酶、有機溶劑以及反應試劑的高度稀釋均不影響其結合。因此，BAS穩(wěn)定性高，特異性強。,第三節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)的特點,適用性廣泛：BAS的多級放大作用，以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標記材料，使BAS不僅用于微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究，亦可制成親和介質用于上述各類反應體系中反應物的分離、純化。其他：可制成通用試劑（如生物素化二抗等）；反應試劑可高度稀釋，特別是與一抗偶聯(lián)使用可大幅減少一抗用量，降低實驗成本；實驗所需時間不長。,第四節(jié)生物素-親合素系統(tǒng)的應用,生物素與親合素之間結合的親合力高、特異性強，各自均可以與各型大小分子結合，以及二者在結合反應時具有的多級放大作用等優(yōu)越性，使BAS及其相關技術被廣泛應用在各種標記免疫分析技術領域中，尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻。,一、生物素-親合素系統(tǒng)基本類型及原理,BAB法：Ag+BAbAg-AbBA/SAAg-AbB-A/SABEAg-AbB-A/SA-BE特點：以游離A/SA分別連接B-Ab和B-E,BA法，也稱標記親合素-生物素法:（labeledavidin-biotin,LAB）Ag+BAbAg-AbBAE/SAEAg-AbB-A/SAE特點：以AE/SAE代替BAB法中的A/SA，省卻了加BE的步驟,3.,ABC法A+BEA-BE-ABCAg+BAbAg-AbBABCAg-AbB-ABC特點:將BAB法中的A先與B-E結合，制備成復合物ABC,網(wǎng)絡了大量酶分子，使該法的檢測靈敏度顯著提高。,BAB與ABC成員相同，反應順序不同,此外，按待檢反應體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，BAS分為直接法和間接法。,BAS實驗方法及反應層次,二、生物素-親合素系統(tǒng)在酶免疫測定中的應用,BAS在ELISA中的應用：BAS用于固相化抗原/抗體的制備AV/SA先包被固相載體、抗原/抗體先與生物素結合AV/SA-B反應而使抗原/抗體固相化。BAS用于ELISA的終反應放大BA-ELISA、BAB-ELISA、ABC-ELISABAS在均相酶免疫測定中的應用：BE*AA-BE（酶因活性中心受空間位阻作用而失活）反應系統(tǒng)：BE*、AgA、Ab（限量）、標準Ag/待檢AgAgA和待檢Ag競爭結合限量Ab，若AgAgAbAgAAgA-BE酶活性變化與待測標本中抗原濃度呈負劑量相關。（酶活性降低）,三、生物素-親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術中的應用,BAS用于熒光抗體技術可明顯提高方法的靈敏度和特異性，通常采用BA法，即用熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的生物素（BAB法）或熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。BAS用于時間分辨熒光免疫分析也可以將反應信號放大。,四、生物素-親合素系統(tǒng)在放射免疫測定中的應用,BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測體系偶聯(lián)，用于對終反應的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反應后B、F成分的分離,五、生物素-親合素系統(tǒng)在分子生物學中的應用,以生物素標記核酸探針進行的定位檢測用BAS制備的親和吸附劑進行基因的分離純化將免疫測定技術與PCR結合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測如DNAB-SAProA-IgG-Ag,Ag和DNA間建立對應關系，從而將對蛋白質的檢測轉化為對核酸的檢測，抗原抗體反應的特異性與PCR技術的高度敏感性相結合，其檢測靈敏度可達10-21mol水平，是迄今最敏感的分析方法。,思考題,生物素的分子結構特點是什么？生物素通過什么結構、形式與生物大分子相連結？親合素或鏈霉親合素的分子結構、理化性質有何特點？為什么親合素、鏈霉親合素具有“橋聯(lián)”作用？親合素、鏈霉親合素可以被哪些示蹤劑標記？為什么生物素親合素系統(tǒng)具有放大作用？生物素與親合素或鏈霉親合素的結合是否與抗原抗體結合相同？生物素親合素系統(tǒng)放大的是反應過程還是單一檢測信號？生物素、親合素或鏈霉親合素如何與標記免疫技術聯(lián)接？如何將生物素鏈霉親合素放大系統(tǒng)用于所有雙位點ELISA?,小結,生物素親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多級放大獨特效應，可極大地提高分析測定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結合以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標記材料的特性，使該系統(tǒng)在標記免疫分析技術領域中的應用具有很強的穩(wěn)定性和適用性。該系統(tǒng)有二種基本類型：以游離親合素為中間物，分別連接包含生物素化大分子的待檢反應體系和標記生物素的BAB法或ABC技術；另一類是直接用標記親合素連接生物素化大分子反應體系進行檢測的BA法或LAB。此外，