枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究.doc

畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文) 課 題 名 稱 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究 2014 年 5 月 15 日 目 錄 摘 要2 Abstract3 1 前言 4 2 材料與方法7 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料7 2.2 主要儀器與設(shè)備7 2.3 試驗(yàn)方法8 3 結(jié)果與分析8 3.1 枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲9 3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果10 3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析13 4 結(jié)論和討論15 5 參考文獻(xiàn)16 6 致謝17 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究 摘 要 本文通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的發(fā)酵 條件（PH、溫度、時(shí)間、接種量）對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響。本實(shí)驗(yàn)的枯 草芽孢桿菌在 BPG 液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過單因?qū)嶒?yàn)及正交試驗(yàn)得到最佳的發(fā) 酵培養(yǎng)條件為：初始 pH 7.0；溫度 35；時(shí)間 20h；接種量為 5%。在此培養(yǎng) 條件下的活菌液量為 3.785107CFU/ml，相比在 LB 培養(yǎng)基下培養(yǎng)時(shí)的活菌液量 3.2106CFU/ml 提高了 10 倍左右。 關(guān)鍵字：關(guān)鍵字：枯草芽孢桿菌；正交試驗(yàn)；生長(zhǎng)量 Optimization study of bacillus subtilis culture conditions Abstract In this paper, we study Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) fermentation conditions (PH, temperature, time, quantity of) the impact on the growth of Bacillus subtilis. The experiment of bacillus subtilis in combined cultivated in liquid medium, is obtained by single for experiment and the orthogonal experiment the best fermentation culture conditions as follows: the initial PH 7.0. Temperature 35 ; Time 20 h; Inoculation quantity was 5%. Under the condition of the cultivation of the best amount of bacterium fluid is 3.785 x 107 cfu/ml, compared to when cultured in LB medium under the microbial quantity: 3.231 x 107 cfu/ml by about 10 times. Key words: Bacillus subtilis; Culture conditions; increment 1 前言 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種好氧性產(chǎn)芽孢桿狀細(xì)菌(G+)1，其基 本特征：桿菌：一般 0.7-0.82.0-3.0 m，電子顯微鏡測(cè)量為 0.5-0.61.1-3.5 m，著色均勻，無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。革蘭氏陽性菌，芽孢 0.60.91.01.5 微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體 不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，常 形成皺醭。 由于枯草芽孢桿菌是需氧菌在水質(zhì)凈化2、工業(yè)發(fā)酵中發(fā)揮著重要的作用， 人們開始致力于研究枯草芽孢桿菌應(yīng)用于這些方面的研究。關(guān)于枯草芽孢桿菌 的研究與應(yīng)用已有 100 多年的歷史，早期大部分工作集中在形態(tài)觀察、分類鑒 定、生理機(jī)制、功能發(fā)掘及防治等方面。近年來，對(duì)枯草芽孢桿菌的研究漸進(jìn) 到遺傳學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，研究?jī)?nèi)容體現(xiàn)在特定功能基因的尋找并克隆到需 要的物種中或者通過誘變、基因工程等手段對(duì)枯草芽孢桿菌生產(chǎn)菌進(jìn)行遺傳改 造等。但目前對(duì)該菌種的研究仍然處于實(shí)驗(yàn)室的初始階段的水平。但是枯草研 報(bào)桿菌有一系列的優(yōu)良性狀吸引這一些的科學(xué)家的目光，他們相信隨著經(jīng)濟(jì)的 發(fā)展，枯草芽抱桿菌資源對(duì)在工、農(nóng)、醫(yī)等方面有重大應(yīng)用價(jià)值，開發(fā)利用更 具有重要意義?？莶菅挎邨U菌是一類廣泛分布于各種不同生活環(huán)境中的革蘭氏 陽性桿狀好養(yǎng)型細(xì)菌，可以產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，耐熱抗逆性強(qiáng)3，在土壤和植物的 表面普遍存在，同時(shí)還是植物體內(nèi)常見的一種內(nèi)生菌，對(duì)人畜無毒無害，不污 染環(huán)境。由于枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，易于存活，定殖與繁 殖，無致病性，并可以分泌多種酶和抗生素4,5，而且還具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)， 用途十分廣泛，國(guó)內(nèi)外有眾多研究單位和學(xué)者對(duì)此菌進(jìn)行了大量研究，也積累 了豐富的研究資料。通過對(duì)枯草芽孢桿菌系列的研究，一方積累枯草芽孢桿菌 規(guī)律信息為以后開發(fā)提供依據(jù)；另一方面也可了解芽孢桿菌與生態(tài)環(huán)境間的相 互關(guān)系，為芽孢桿菌資源的利用奠定基礎(chǔ)6 。 現(xiàn)在對(duì)于枯草芽孢桿菌的主要運(yùn)用方面： （1）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用 隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展和集約化經(jīng)營(yíng)程度的不斷提高，養(yǎng)殖水體污染 日趨嚴(yán)重，許多養(yǎng)殖池中有害藻類及病菌大量繁殖，水質(zhì)條件不斷惡化，其后 果影響到了水產(chǎn)品安全和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展7。利用常規(guī)藥物防治方法，不但 易加重水質(zhì)惡化程度，成本也較高，而利用微生物制劑改善養(yǎng)殖水體環(huán)境受到 人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注?？莶菅挎邨U菌是一種好氧的革蘭氏陽性菌，在自然界廣 泛存在，生命力極強(qiáng)，代謝旺盛，對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境，具有廣譜的抗菌 活性和極強(qiáng)的抗逆能力8?？莶菅挎邨U菌能有效的降解水體中的氨氮、亞硝酸 鹽和硫化物，達(dá)到凈化水質(zhì)的目的。因此，枯草芽孢桿菌在養(yǎng)殖水體的生物修 復(fù)方面得到了廣泛的應(yīng)用9,10。 在水體或飼料中添加枯草芽孢桿菌制劑，可以有效抑制或殺滅水體中或養(yǎng) 殖生物體內(nèi)的某些有害致病菌，并且能增強(qiáng)有益菌的群落，而達(dá)到防治水產(chǎn)疾 病的目的；芽孢桿菌可以降低水體中硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量，從而起到改善 水質(zhì)的作用11；芽孢桿菌還可以通過消滅病原體或減少病原體的影響來改善水 質(zhì)；枯草芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)中的弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害微生物有很強(qiáng) 的抑制作用，有效預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物腸炎，爛鰓等疾病。同時(shí)枯草芽孢桿菌也可以 分泌大量幾丁質(zhì)酶的功能。幾丁質(zhì)酶可分解病原真菌的細(xì)胞壁而抑制真菌病害， 分解養(yǎng)殖池中的有毒有害物質(zhì)，凈化水質(zhì)12-14；也可以分解池中殘餌、糞便、 有機(jī)物等，具有很強(qiáng)的清理水中垃圾小顆粒的作用。 枯草芽孢桿菌還可以改善有害藍(lán)藻泛溢造成的水質(zhì)渾濁問題，水質(zhì)由渾變 清，具有很強(qiáng)的凈化水質(zhì)功能。其在水中大量繁殖時(shí)分泌的胞外酶可分解、吸 收水及底泥中的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等有機(jī)物，有降低水體富營(yíng)養(yǎng)化和清除底 泥的作用。在作用過程中，能夠促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素降解，有機(jī)營(yíng)養(yǎng)一部分轉(zhuǎn)化 為細(xì)胞物質(zhì)，大部分轉(zhuǎn)化為細(xì)菌活動(dòng)的能量。在其轉(zhuǎn)化過程中，氨氣、氮?dú)饩?從水中逸散到大氣用這種方法，水中氨氮和硝基氮可除去 。另一部分有機(jī)營(yíng)養(yǎng) 轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢(shì)的有益菌體，此法廣泛應(yīng)用于河蟹、育苗、蝦、甲魚養(yǎng)殖15。 （2）在食品工業(yè)上的應(yīng)用 血栓性疾病嚴(yán)重威脅著人類的生命與健康，其發(fā)病率和死亡率居各種疾病 之首。大量的研究表明，飲食習(xí)慣與動(dòng)脈硬化和血栓等疾病有密切的關(guān)系，納 豆是日本的傳統(tǒng)食品，已經(jīng)有 2000 多年的歷史。納豆是由納豆芽孢桿菌或枯草 芽孢桿菌發(fā)酵大豆而成。日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)在枯草桿菌發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)納豆(Natto)食品 中含有一種具有溶解血栓功能的納豆激酶(Nattokinase)是一種枯草桿菌蛋白激酶 16，可簡(jiǎn)稱為枯激酶(Bacillokinase)。該酶在體內(nèi)除可溶解血栓外，明顯地縮短 優(yōu)球蛋白的溶解時(shí)間(ELT)，以及激活體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生 t-PA，由此可 見，可探索開發(fā)一種新的溶栓藥品。納豆是日本的傳統(tǒng)食品，已經(jīng)有 2000 多年 的歷史。由于納豆中含有能溶解血栓的納豆激酶17，因此很適合作為一種保健 食品每天食用。研究表明，每天食用 150 g 新鮮納豆可起到預(yù)防血栓類疾病的 作用。另外，常吃納豆對(duì)癌癥、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈硬化、肥胖病等均可起 到預(yù)防和緩解及治療作用. 納豆枯草芽孢桿菌能在腸道內(nèi)生長(zhǎng)，分泌各種酶和維生素，促進(jìn)小腸黏膜 細(xì)胞的增殖18-19，促進(jìn)胃腸道各種消化酶活性，并具有抑制腸道內(nèi)有害菌的作 用，能夠?qū)⑷祟惣捌渌麆?dòng)物難以消化吸收的大豆蛋白發(fā)酵形成大豆多肽和小分 子物質(zhì)的混合物；同時(shí)此菌在不利環(huán)境中形成芽胞，能耐高溫高壓，經(jīng)受飼料 加工工藝要求，易貯存。目前很多研究均顯示，枯草芽胞桿菌可以產(chǎn)生多種抗 菌物質(zhì)20抑制病原菌的繁殖并且對(duì)生物體本身無害，可提高養(yǎng)殖動(dòng)物的產(chǎn)品質(zhì) 量，是一種應(yīng)用非常廣泛的益生菌。因此，近年來枯草芽胞桿菌在飼料開發(fā)和 生物防治等領(lǐng)域的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)。 （3）在醫(yī)藥方面的應(yīng)用 枯草芽孢桿菌的活菌制劑可以作為口服液用于治療腸炎、支氣管炎和腹瀉 等多種疾病，也用來預(yù)防和治療燒傷面的感染?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌提 取到的淀粉酶、纖維素酶能夠補(bǔ)充體內(nèi)消化酶的不足，恢復(fù)正常消化機(jī)能；蛋 白酶能夠分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽腐肉和碎屑。 枯草芽孢桿菌能夠分泌多種酶，其中能夠應(yīng)用到醫(yī)藥領(lǐng)域的酶主要有絲氨 酸纖溶性蛋白酶 ( 納豆激酶) 和脂肪酶兩種21。日本人日常生活中食用的納豆 就是利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的，納豆中含有的納豆激酶對(duì)心血管疾病有很好的 預(yù)防和治療作用。近年來，我國(guó)也掀起對(duì)納豆激酶的研究和開發(fā)熱潮，納豆激 酶的藥用價(jià)值日益突出，在我國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品豆豉中發(fā)現(xiàn)了類似納豆激酶 的高活力的纖溶酶，將其產(chǎn)生菌株鑒定為枯草芽孢桿菌，并將豆豉纖溶酶基因 克隆到了畢赤酵母中。同樣由枯草芽孢桿菌合成的聚谷氨酸也可用作藥物緩釋 材料和醫(yī)用高分子纖維材料等 。 隨著人們對(duì)枯草芽孢桿菌性質(zhì)的深入，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌具有穩(wěn)定性好、抗性 強(qiáng)、耐高溫、耐酸堿1、抑制病原菌繁殖、 產(chǎn)生多種酶類、提高動(dòng)物消化酶活 性、分解有機(jī)污染物、凈化水質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中；于 此同時(shí)枯草芽孢桿菌又可以產(chǎn)生微生物源性抗菌蛋白2；從而國(guó)內(nèi)外研究者掀 起對(duì)拮抗菌株的篩選、鑒定以及其抗菌物質(zhì)理化特點(diǎn)等方面進(jìn)行了大量研究工 作的熱潮，雖然在實(shí)際的應(yīng)用中，大多停留在實(shí)驗(yàn)室等機(jī)構(gòu)試驗(yàn)階段，但它所 展現(xiàn)的應(yīng)用前景卻十分廣闊。 枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)條件掌握不好，常出現(xiàn)活菌數(shù)量低、 芽孢形成率低等問題，所以本課題嘗試通過改變 BPG 培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件來提高 枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量，期望解決在現(xiàn)階段的工業(yè)化生產(chǎn)中存在著的菌數(shù)量低、 成本高的問題。 本課題是針對(duì)菌株適宜培養(yǎng)基的發(fā)酵條件進(jìn)行研究。針對(duì)發(fā)酵液培養(yǎng)基中 不同溫度、pH、菌種接種量、時(shí)間分別進(jìn)行單因素水平的試驗(yàn)，確定三個(gè)較好 的水平，在進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)以確定枯草芽孢桿菌的最佳條件。對(duì)此 我們對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。 研究的目的是通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件，提高芽孢桿菌菌株發(fā)酵液的含 菌量，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，有助于降低生產(chǎn)成本。 2 材材料料與與方方法法 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料 2.2.1 材料 枯草芽孢桿菌（湖南師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供） 2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 牛肉膏；蛋白胨；葡萄糖；可溶性淀粉；氯化鈉；磷酸氫二鉀；硫酸錳； 瓊脂；去離子水 2.2 主要儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)；滅菌鍋；培養(yǎng)皿若干；電子天平；250ml 錐形瓶若干；玻璃 棒；酒精燈；試管；移液管；移液槍；分光光度計(jì) 2.3 試驗(yàn)方法 2.3 實(shí)驗(yàn)過程 曲線制備 單因素測(cè)定 正交試驗(yàn) 2.3.1 培養(yǎng)基及基礎(chǔ)條件確定 培養(yǎng)基 BPG 培養(yǎng)基22：牛肉膏 3.3、蛋白胨 3.3、葡萄糖 3.3、淀粉 3.3、Nacl 3.3、KH2PO4 3.3、MnSO47H2O 0.2，加純化水定容至 1 000ml，調(diào) PH 值為 7.0 初始培養(yǎng)條件：接種量：5-10%；pH：7.0-7.2；溫度： 30-35；時(shí)間：16-20 h。 2.3.2 比濁法測(cè)定細(xì)菌濃度 比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中細(xì)胞的濃度與混濁度成正比，即與 光密成正比，菌越多，光密度越大。因此用分光光度計(jì)在一定波長(zhǎng)（420nm） 下，測(cè)定菌懸液的以光密度（即 OD 值）表示菌量。 枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線的確定在 BPG 液體培養(yǎng)基上接種枯草芽孢桿菌 原菌液，按優(yōu)化條件培養(yǎng)，并每隔 3h 取樣測(cè)定 OD 值和平板菌落計(jì)菌數(shù)。 3 結(jié)果與分析 3.1 枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線 在確定的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每隔 3 小時(shí)取樣測(cè)定 OD 值，并且通過平板菌 落計(jì)菌數(shù)如下表一。 時(shí)間 （h） 03691215182124 OD 0.0080.0340.0850.1120.1530.2110.2780.2460.245 活菌數(shù) (107CF U/ml) 0.100.501.301.802.603.103.603.303.10 OD 值與活菌數(shù)的關(guān)系如下圖 1。 從圖 1 可以看出 OD 值與活菌數(shù)呈現(xiàn)的關(guān)系，得到的關(guān)系式 Y=1.3108X+1.6106 R2=0.9706。在 OD 值在小于 0.278 時(shí) OD 值和活菌數(shù)呈 現(xiàn)線性的關(guān)系。 3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果 在確定BPG液體培養(yǎng)基的基本組成成分（0.34g牛肉膏、0.34g蛋白胨、 0.34g葡萄糖、0.33g磷酸二氫鉀、0.33g氯化鈉、0.33g淀粉、0.02g硫酸錳、 pH7.0、100ml水）的前提下，通過四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)確定葡萄糖、蛋白胨、牛肉 膏、磷酸二氫鉀的最適含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。 3.2.1 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 本實(shí)驗(yàn)選取 25、30、35、40、45 5 個(gè)溫度為培養(yǎng)溫度的變化來研究溫度 對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)量的影響。培養(yǎng)基的接種量為 5%、初始 pH 7.0，培養(yǎng) 18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測(cè)定 OD420值，根據(jù)最大生長(zhǎng)量，選 出最適溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表二及圖 2。 表二 不同溫度對(duì)枯草芽孢桿菌的 OD420值影響 溫度 OD420值 2530354045 A10.2010.2400.2700.2190.199 A20.2030.2410.2710.2210.199 A30.2050.2420.2720.2230.199 平均值0.2030.2410.2710.2210.199 圖 2 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 圖 2 顯示，當(dāng)溫度的變化分別為 25、30 、35 、40 以及 45時(shí)， 到的活菌數(shù)（107CFU/ml）分別為 2.799、3.293 、3.683、 3.033 以及 2.747。 所以有圖 2 分析可知，起初隨著溫度的升高，活菌數(shù)目會(huì)增加，當(dāng)溫度為 35 時(shí)，枯草芽孢桿菌的數(shù)量達(dá)到最多；隨后繼續(xù)升高溫度，反而枯草芽孢桿菌的 數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由于溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響是影響在生物體內(nèi)所進(jìn)行的 許多生化反應(yīng)，達(dá)到影響微生物的生長(zhǎng)。在一定溫度范圍內(nèi)，生化反應(yīng)速率隨 溫度上升而加快；超過一定限度，則細(xì)胞功能下降以至死亡。故此溫度的選擇 為35 適宜。 3.2.2 pH 值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 本實(shí)驗(yàn)選取 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 5 個(gè) PH 為培養(yǎng)時(shí) PH 的變化來研究 PH 對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)量的影響。培養(yǎng)基的接種量為 5%、初始溫度 35，培 養(yǎng) 18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測(cè)定 OD420值，根據(jù)最大生長(zhǎng)量， 選出最適 PH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表三及圖 3。 表三不同 pH 對(duì)枯草芽孢桿菌的 OD420值影響 pH 值 OD420值 5.06.07.08.09.0 A1 0.1790.2130.2550.2010.178 A2 0.1780.2130.2560.2020.176 A3 0.1770.2130.2570.2000.177 平均值 0.1780.2130.2560.2010.177 圖 3PH 對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 從圖 3 顯示，當(dāng) PH 變化分別為 5、6、7、8 以及 9 時(shí)，得到的活菌數(shù) 為：（107CFU/ml）分別為 2.474、2.929、3.488、2.773 以及 2.461。所以從圖 3 直觀分析可知：開始隨著 PH 的增加，活菌數(shù)量呈現(xiàn)增加，當(dāng) PH 為 7.0 時(shí)枯 草芽孢桿菌的數(shù)量達(dá)到最多；隨后繼續(xù) PH 增加，反而枯草芽孢桿菌的數(shù)量呈 現(xiàn)下降趨勢(shì)。由于不同微生物對(duì) pH 條件的要求各不相同它們只能在一定的 pH 范圍內(nèi)生長(zhǎng)，對(duì) pH 條件的不同要求在一定程度上反映出微生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng) 能力。本實(shí)驗(yàn)的枯草芽孢桿菌在 PH6 到 PH8 之間的生長(zhǎng)時(shí)的活菌數(shù)相對(duì)變化差 距不大，從而可知在中性環(huán)境下相對(duì)適合枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)；在 PH9 下的活菌數(shù)相比較少，可知在過酸和過堿的環(huán)境相對(duì)不適應(yīng)枯草芽孢桿菌的生 長(zhǎng)，故此最適 PH 為 7.0。 3.2.3 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 本實(shí)驗(yàn)選取 1%、3%、5%、7%、9% 5 個(gè)接種量為培養(yǎng)時(shí)接種量的變化來 研究接種量對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)量的影響。培養(yǎng)基的初始 PH 為 7.0、初始溫 度 35，培養(yǎng) 18 h，的其他因素的變量不變的條件下，測(cè)定 OD420值，根據(jù)最 大生長(zhǎng)量，選出最適 PH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表四及圖 4。 表四不同接種量對(duì)枯草芽孢桿菌的 OD420 值影響 接種量 OD420值 1% 3% 5% 7%9% A1 0.1440.1770.2340.2100.188 A2 0.1450.1780.2340.2120.189 A3 0.1460.1790.2340.2110.190 平均值 0.1450.1780.2340.2110.189 圖 4 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 從圖 4 顯示，當(dāng)接種量變化分別為 1%、3%、5%、7%以及 9%時(shí)，得到的 活菌數(shù)為（107CFU/ml）：2.045、2.474、3.202、2.903 以及 2.617。所以從圖 4 直觀分析可知：接種量從 1%到 5%之間增加接種量，活菌數(shù)隨著接種量的增 加而增多，當(dāng)接種量 5%活菌數(shù)達(dá)到最多；大于 5%時(shí)隨著接種量的增加反而活 菌數(shù)減少，反到不利于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。故選擇最佳的接種量為 5%。 3.2.4 時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 本實(shí)驗(yàn)選取 14h、16h、18h、20h、22h 5 個(gè)時(shí)間為培養(yǎng)時(shí)時(shí)間的變化來研 究時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)量的影響。培養(yǎng)基的初始 PH 為 7.0、初始溫度 35，接種量為 5%，的其他因素的變量不變的條件下，測(cè)定 OD420值，根據(jù)最 大生長(zhǎng)量，選出最適 PH。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表五及圖 5。 表五不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌的 OD420 值影響 時(shí)間 OD420值 14h16h18h20h22h A1 0.1610.2200.2760.2750.245 A2 0.1610.2210.2770.2750.246 A3 0.1610.2220.2780.2750.247 平均值 0.1610.2210.2770.2750.246 圖 5 時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響 圖 5 顯示，當(dāng)時(shí)間的變化分別為 14h、16h 、18h、20h 以及 22h 時(shí)，到的活 菌數(shù)（107CFU/ml）分別為 2.253、3.033 、3.761、 3.735 以及 3.258。所以有 圖 5 分析可知，起初隨著時(shí)間的推移，活菌數(shù)目會(huì)增加，當(dāng)時(shí)間為 18h 時(shí)，枯 草芽孢桿菌的數(shù)量達(dá)到最多；隨后繼續(xù)增加培養(yǎng)時(shí)間，反而枯草芽孢桿菌的數(shù) 量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由于時(shí)間主要影響枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)周期，培養(yǎng)的時(shí)間過 長(zhǎng)反而使得其處于衰退期不利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，影響它的數(shù)量。故時(shí)間 的選擇為18h適宜。 3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 參照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了 BPG 培養(yǎng)基（牛肉膏 3.3、蛋白胨 3.3、葡萄糖 3.3、淀粉 3.3、Nacl3.3、KH2PO4 3.3、MnSO47H2O 0.2、水 1000ml）以影響枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)條件 PH、溫度、時(shí)間、接種量 為四個(gè)影響因素，取各自的三個(gè)不同水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表 表 3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)直觀分析表 因素 序列號(hào) A 溫度 B pH C 接種量濃度 D 時(shí)間(h) 活菌數(shù) （107CFU/ml ） 1 1（30） 1（6）1（3%）1(16) 2.643 212（7）2（5%）2(18) 3.566 313（8）3（7%）3(20) 2.266 42（35）123 3.163 52231 2.916 62312 2.591 73（40）132 2.162 83213 3.162 93321 2.747 K18.4757.9688.3968.306 K28.6709.6449.4768.319 K38.0717.6047.3448.591 R0.1990.6800.7110.095 最優(yōu)組合 A2B2C2D3 由表數(shù)據(jù)可知，因素主次關(guān)系為 C(接種量濃度) B(PH) A(溫度) D（時(shí)間） 。 通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀分析，2 號(hào)組合 A1B2C2D2的菌體含量最高；但是經(jīng)過 計(jì)算分析的最優(yōu)水平為 A2B2C2D3。所以為了確定最優(yōu)水平組合，分別按照這兩 個(gè)水平組合的培養(yǎng)基配方，配制 BPG 液體培養(yǎng)基下培養(yǎng)，測(cè)定其 OD420值，根 據(jù)生長(zhǎng)量，確定最優(yōu)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表六。 表六 組合 活菌數(shù) （107CFU/ml） 直觀最優(yōu)組合 A1B2C2D2 分析的最優(yōu)組合 A2B2C2D3 A1 3.5603.768 A2 3.5623.766 A3 3.5613.777 平均值 3.5613.777 從表六看出直觀的最優(yōu)組合 A1B2C2D2與分析得到最優(yōu)組合 A2B2C2D3 比較，在直觀的最優(yōu)組合 A1B2C2D2下活菌數(shù)量為 3.561107CFU/ml，但是分析 得到最優(yōu)組合 A2B2C2D3下得到的活菌數(shù)量為 3.777107CFU/ml。再由表 3.3 分 析可知，因素主次關(guān)系為 C(接種量濃度) B(PH) A(溫度) D（時(shí)間） ，所 以分析的得到的最優(yōu)組合 A2B2C2D3較好。即在溫度為 35，接種量為 5%，PH 為 7.0 培養(yǎng)時(shí)間為 20h。在這條件下培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌數(shù)量最多。 4 結(jié)論和討論 本文針對(duì)的是枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究 ，在培養(yǎng)基 BPG 的基礎(chǔ) 上優(yōu)化培養(yǎng)條件（PH，時(shí)間，溫度，接種量濃度）四個(gè)因素，再進(jìn)行 L9（34）正交試驗(yàn)確定枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件。最終確定在保證其他因 素不變的情況下枯草孢桿菌在 BPG 培養(yǎng)基在接種量為 5%，PH 為 7.0，溫度為 35 攝氏度，時(shí)間為 20h 的時(shí)候適合枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，在此培養(yǎng)條件下得到 的活菌液量為 3.785107CFU/ml，相比在 LB 培養(yǎng)基下培養(yǎng)時(shí)的菌液量 3.2106CFU/ml 提高了 10 倍左右，進(jìn)一步提高的枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量。 在本次實(shí)驗(yàn)過程中，有以下幾點(diǎn)心得體會(huì) 1 本文在優(yōu)化培養(yǎng)條件時(shí)，得到接種量濃度為最主要的因素，相對(duì)而言時(shí) 間為次要的因素。接種量濃度對(duì)于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)影響較大，從而工業(yè)化 大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)候需要注意接種量的濃度。培養(yǎng)的時(shí)間從圖 4 可以看出 18h 到 20h 之間活菌數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，如果需要得到是枯草芽孢桿菌的菌體或者產(chǎn)物時(shí)， 需要控制發(fā)酵時(shí)間在 18h 到 20h 之間有利于菌體和產(chǎn)物的積累。 2 本文是枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在培養(yǎng)基 BPG 的基礎(chǔ)上優(yōu)化培 養(yǎng)條件（PH，時(shí)間，溫度，接種量濃度）四個(gè)因素，再進(jìn)行L9（34）正交試 驗(yàn)確定枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件得到的活菌量為 3.785107CFU/ml，但是 唐家毅23等在一株水產(chǎn)芽孢桿菌的鑒定及其培養(yǎng)基優(yōu)化的研究得到的最佳細(xì)胞 濃度為 8.42109CFU/ml，相比對(duì)于培養(yǎng)條件對(duì)于枯草芽孢桿菌的影響，沒有培 養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌的影響明顯。 3 相對(duì)與普通培養(yǎng)基得到的活菌量 3.2106CFU/ml，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的活菌 量 3.785107CFU/ml 還有有明顯的提高 10 倍，所以本文枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條 件的優(yōu)化對(duì)于工業(yè)化大規(guī)模的培養(yǎng)枯草芽孢桿菌還是能夠提供一些依據(jù)。 4 由于條件的因素本實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，各因素水平的跨度相對(duì)較大，如 溫度的變化梯度為 5，時(shí)間的變化梯度 2h，接種量變化跨度為 2%，PH 的變 化梯度為 1。對(duì)于以后的實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)縮小這變化的跨度，來進(jìn)一步研究枯草 芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化。 5 參考文獻(xiàn) 1 惠明,竇麗娜,田青等.枯草芽孢桿菌的應(yīng)用研究進(jìn)展J.安徽農(nóng)業(yè)科 2008,36(27)11623-11624. 2 陳尚智,胡勇有.枯草芽孢桿菌對(duì)微污染水體的凈化作用J.環(huán)境科學(xué)報(bào),2011(8):1594-1601. 3 李晶,楊謙.生防枯草芽孢桿菌的研究進(jìn)展J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2008,36(1):106-111. 4 穆昭艷,汪立平,張大兵,等 異甘露聚糖酶生產(chǎn)菌的誘變育種及固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化J.食 品科學(xué),2012,33(5):220-225. 5 李佳.枯草桿菌特征和應(yīng)用現(xiàn)狀J. 肉類研究,2009,77(29):18-21. 6WichitraLeelasuphakul,PranomSivanunsakul,SouwalakPhongpaichit.Purification,characterizatio n and synergistic activity of -1,3-glucanase and antibiotic extract from an antagonistic Bacillus subtilis NSRS 89-24 against rice blast and sheath blightJ. 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