臨床PCR檢驗(yàn)標(biāo)本的采集、處理、保存及核酸提取方法ppt課件

臨床PCR檢驗(yàn)標(biāo)本的采集、處理、保存及核酸提取方法,江西省腫瘤醫(yī)院陳文學(xué),1,檢驗(yàn)誤差的發(fā)生率,1997年，一位意大利著名檢驗(yàn)專(zhuān)家對(duì)急診檢驗(yàn)誤差發(fā)生的種類(lèi)和發(fā)生率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，約有68.2%的檢驗(yàn)誤差發(fā)生在檢驗(yàn)前期，而來(lái)自檢驗(yàn)中期和檢驗(yàn)后期的誤差率分別為13.3%和18.5%。2007年，這位專(zhuān)家又進(jìn)行了類(lèi)似的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，檢驗(yàn)前期的誤差發(fā)生率仍高達(dá)61.9%,2,正確采集、運(yùn)送、保存臨床標(biāo)本的重要性,質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一,3,核酸提取的重要性,核酸提取是臨床PCR檢驗(yàn)最為關(guān)鍵的部分核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗(yàn)的正確與否臨床PCR檢驗(yàn)操作中最易出問(wèn)題的環(huán)節(jié),4,標(biāo)本采集,標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響（過(guò)早或過(guò)晚都可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果）標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備（適度消毒）標(biāo)本的類(lèi)型和采集量（衣原體上皮細(xì)胞）采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)（評(píng)價(jià)方法：肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化學(xué)分析）采樣及運(yùn)輸容器（一次性無(wú)菌器材,防腐劑,抗凝劑）標(biāo)本采集中的防污染（一次性無(wú)菌容器，防止混入操作者頭發(fā)，表皮等，如玻璃容器要高壓滅菌）,5,標(biāo)本運(yùn)送,樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測(cè)定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測(cè)定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。,6,臨床標(biāo)本的處理和保存,血清（漿）全血外周血單個(gè)核細(xì)胞痰棉拭子膿液體液乳汁組織,7,血清（漿）,DNA測(cè)定，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對(duì)測(cè)定影響不大。RNA測(cè)定，標(biāo)本的獲取和保存方式對(duì)測(cè)定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴(yán)禁使用肝素，因其對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制，且很難在核酸提取過(guò)程中完全去除)全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時(shí)內(nèi))分離血清，標(biāo)本的短期（12周）保存可在-20下，較長(zhǎng)期保存應(yīng)在-70下。,8,全血,以全血作為待測(cè)標(biāo)本時(shí),必須注意抗凝劑的選擇,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測(cè),可4下短期保存,如用于RNA檢測(cè)，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA。,9,外周血單個(gè)核細(xì)胞,外周血單個(gè)核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液,裂解全血中的紅細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌,即可得到單個(gè)核細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞如暫不提取核酸,可保存于-70下.,10,痰,痰屬于分泌物,臨床上常用作為結(jié)核桿菌DNA測(cè)定標(biāo)本。痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì),故在核酸提取時(shí),需對(duì)樣本進(jìn)行初步處理，即用1mol/LNaOH或變性劑液化。如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測(cè)，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取,可保存于-70下。,11,痰標(biāo)本處理的基本模式,通用模式簡(jiǎn)單模式,12,痰標(biāo)本處理通用模式,（1）通用標(biāo)本處理（Universalsampleprocessing,USP）溶液：4-6mol/L鹽酸胍（GuHCl）50mmol/LTris-HCl,pH7.525mmol/LEDTA0.5%十二烷基肌酸鈉（Sarkosyl）0.10.2mol/L-巰基乙醇。（2）0.05%Tween80。（3）10%Chelex-100(含0.03%TritonX-100和0.3%Tween20),13,14,痰標(biāo)本處理簡(jiǎn)單模式,試劑：（1）裂解液:含終濃度0.1mol/LNaOH、50g蛋白酶K和0.05%TritonX-100,15,痰標(biāo)本處理中要注意的問(wèn)題,痰標(biāo)本在沒(méi)有加入內(nèi)標(biāo)以控制假陰性的情況下，不能采用異硫氰酸胍鹽（GuSCN）方法提取。采用這種方法提取，有可能會(huì)在提取過(guò)程中，出現(xiàn)一種可修飾DNA的酶，在最后一步提取中，與核酸一起洗提出來(lái)，從而抑制其后的擴(kuò)增。在PCR主反應(yīng)混合液中，加入-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此類(lèi)抑制物產(chǎn)生的效果。,16,棉拭子,在使用PCR方法檢測(cè)性病病原體時(shí),臨床標(biāo)本一般為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置510分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清立即離心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,則需保存于-70下.,17,膿液,膿液的處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測(cè)定的標(biāo)本,粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心,沉淀用生理鹽水洗23次后,即可用于DNA提取。對(duì)于用于非分枝桿菌測(cè)定的膿液標(biāo)本,如過(guò)于粘稠,則加入適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清立即離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標(biāo)本的保存條件同樣為-70。,18,體液,臨床體液標(biāo)本包括胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本的保存同上。,19,乳汁,乳汁有時(shí)也可作為標(biāo)本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等的PCR檢測(cè)。,20,乳汁中分枝桿菌DNA的提取,試劑準(zhǔn)備裂解液：50mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA,2%TritonX-100,4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）,0.3mol/L醋酸鈉。玻璃珠：（直徑：425-600um）,21,22,組織,組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保存于50%乙醇中,具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm的小片,加入適量的生理鹽水,然后,邊搖邊加入無(wú)水乙醇至終濃度為50%.這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日,4可保存6年。石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取。,23,臨床標(biāo)本的濾紙上保存,臨床標(biāo)本置于經(jīng)過(guò)處理的濾紙片上，如靶核酸為DNA，可室溫保存數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。保存在濾紙上的標(biāo)本，保存時(shí)間長(zhǎng)，還可因?yàn)闃?biāo)本中的PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對(duì)后面的擴(kuò)增檢測(cè)造成影響。不管是全血、血清（漿）。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。,24,臨床標(biāo)本中PCR反應(yīng)抑制物,內(nèi)源性的:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類(lèi)、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。外源性的:如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過(guò)度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。,25,肝素的作用機(jī)理,肝素對(duì)MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQDNA聚合酶均很強(qiáng)的抑制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過(guò)程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過(guò)濾、酸堿處理后凝膠過(guò)濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。,26,肝素的作用機(jī)理,每g核酸標(biāo)本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。在標(biāo)本中加入肝素酶I或13U/g核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNase252小時(shí))可去除肝素的抑制作用。,27,血紅蛋白、乳鐵蛋白,血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)的主要PCR抑制物,它們均含有鐵。抑制機(jī)制可能是：（1）與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關(guān)。研究鐵的抑制效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性,28,IgG,IgG的抑制作用是由于其與單鏈DNA的相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用使用煮沸作為標(biāo)本處理方法或使用PCR前的熱啟動(dòng),將增強(qiáng)IgG對(duì)PCR反應(yīng)的抑制,29,去除或減輕抑制的一些方法,NaOH處理可中和臨床標(biāo)本中的TaqDNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于DNA含量低的標(biāo)本，因?yàn)镹aOH處理可使DNA大量丟失。,30,去除或減輕抑制的一些方法,加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液對(duì)TaqDNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴(kuò)增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加TaqDNA聚合酶的擴(kuò)增能力，使其對(duì)糞便和肉類(lèi)標(biāo)本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20倍。單鏈DNA結(jié)合T4基因32蛋白（gp32）有類(lèi)似BSA的增強(qiáng)效應(yīng)。,31,核酸純化,核酸分離純化技術(shù)起源于二十世紀(jì)五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)的核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍的應(yīng)用和推廣。傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。,32,一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理,靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測(cè)定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。,33,核酸的分離純化,核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類(lèi)等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。經(jīng)典方法硅吸附法對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。,34,DNA提取的經(jīng)典方法,即所謂的”酚-氯仿提取法”,35,36,RNA提取的獨(dú)特性,臨床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,存在大量對(duì)RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。如何避免RNase對(duì)標(biāo)本的污染及防止RNase對(duì)提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在。,37,RNA提取所用器皿的處理,經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無(wú)RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA.實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180干烤8小時(shí)以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品。DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑。灌滿(mǎn)DEPC的器皿于37下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過(guò)羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。,38,RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備,對(duì)于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專(zhuān)用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過(guò)的藥匙稱(chēng)取試劑,將溶液裝入無(wú)RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?huà),溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37至少處理12小時(shí),然后于100加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘。須注意的是,DEPC可與胺類(lèi)迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來(lái)處理含有Tris一類(lèi)的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開(kāi)封的Tris試劑以制備無(wú)RNase的溶液。,39,RNA提取中RNase污染的控制,實(shí)驗(yàn)操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來(lái)源。策略是：在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時(shí),以及在涉及RNA的整個(gè)提取操作過(guò)程中,都應(yīng)戴一次性手套。在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。,40,RNA提取的常用方法,表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。,41,異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-酚提取法,42,核酸提取的改良方法,旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）方法玻璃粉吸附法二氧化硅（Se）或硅藻吸附法微量全血核酸提取法：NaI方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自動(dòng)核酸純化儀,43,旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）,屬于硅吸附方法的一種。在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€(gè)部分：（1）利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來(lái)（2）把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當(dāng)然這種載體只對(duì)核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力而對(duì)其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)則不相親和也不吸附（3）把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來(lái)，從而得到純化的核酸。,44,45,46,玻璃粉吸附法,47,二氧化硅（Se）或硅藻吸附法,48,使用NaI的微量全血核酸提取法,49,全自動(dòng)核酸純化儀,雅培m2000系統(tǒng)該儀器主要由兩個(gè)機(jī)械臂和八個(gè)單道移液器構(gòu)成，將樣品放入樣品管中后，儀器就可以自動(dòng)工作，利用磁珠法進(jìn)行核酸（DNA/RNA）提取。在樣品提取完成后，儀器還可以進(jìn)行PCR試劑混合步驟?；旧蠜](méi)有手工的操作步驟，最大樣本量：96,50,全自動(dòng)核酸純化儀,美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司SPRI-TE小型化的自動(dòng)提?。?-10個(gè)樣品VidieraNsP大型化的自動(dòng)提取:96樣本,51,全自動(dòng)核酸純化儀,QIAGEN公司生產(chǎn)的BioRobotMDxWorkstation的96通道自動(dòng)化提取工作站。,52,全自動(dòng)核酸純化儀,此外還有羅氏推出的MagNAPureLC2.0System，金麥格自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)。,53,靶核酸提取的質(zhì)量,純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定。核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測(cè)定。核酸純度：可通過(guò)提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標(biāo)本用待評(píng)價(jià)試劑提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，比較所得到的結(jié)果,54,謝謝！,55,56,一、標(biāo)本收集、運(yùn)送、保存1、標(biāo)本收集臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)各種臨床標(biāo)本的收集應(yīng)按檢測(cè)要求建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并對(duì)臨床標(biāo)本采集人員培訓(xùn)。標(biāo)本采集的時(shí)間，應(yīng)在患者疾病發(fā)展過(guò)程中，標(biāo)本采集過(guò)早或過(guò)晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果。,57,（1）標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本采集部位的清潔消毒可去掉污染的微生物或其它雜物，但應(yīng)適度，故標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素的人員進(jìn)行。（2）標(biāo)本的類(lèi)型和采集量標(biāo)本的類(lèi)型和采集量應(yīng)根據(jù)所測(cè)病原體而定。如：定量PCR對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)，應(yīng)選擇患者血腦脊液、胸腹水等標(biāo)本，不宜用痰標(biāo)本，因?yàn)樘抵薪Y(jié)核分枝桿菌分布不均。,58,PCR檢測(cè)衣原體時(shí)，由于衣原體感染上皮細(xì)胞，因此取材一定要取到細(xì)胞，無(wú)論男女取材均應(yīng)用特制的拭子，男性應(yīng)進(jìn)入尿道2-3cm，女性應(yīng)進(jìn)入子宮頸口2cm并停留片刻后取出，在分泌物或尿沉渣中檢出的陽(yáng)性率均較低。一般來(lái)說(shuō)，如果樣本的量對(duì)病原體培養(yǎng)夠用的話(huà)，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴(kuò)增檢測(cè)。,59,（3）采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià)可通過(guò)幾個(gè)方面來(lái)評(píng)價(jià)標(biāo)本采集質(zhì)量，即細(xì)胞組成，所需類(lèi)型細(xì)胞的數(shù)量和核酸總量。評(píng)價(jià)方法包括肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化學(xué)分析等。（4）標(biāo)本采集中的防污染標(biāo)本采集最好采用一次性無(wú)菌器材，采集中要特別注意污染，防止混入操作者的頭發(fā)，表皮細(xì)胞、痰液等。如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的RN