細菌學檢驗基本技術

1,第二章細菌學檢驗基本技術,邵麗軍,2,主要內(nèi)容,第一節(jié)樣本的采集與送檢原則第二節(jié)細菌的分離培養(yǎng)方法第三節(jié)細菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)檢查法第四節(jié)細菌的生化反應檢查法第五節(jié)細菌的血清學檢驗第六節(jié)細菌毒素的檢測第七節(jié)細菌數(shù)量的測定第八節(jié)細菌L型檢驗第九節(jié)微生物菌種的保藏及保管,3,第一節(jié)樣本的采集與送檢原則,一、細菌學檢驗樣本的類型正常人體樣本，如排泄物、血液、血清等食品、水產(chǎn)品、化妝品、藥品、消毒及衛(wèi)生用品、醫(yī)療用品及環(huán)境（水、土壤、空氣，各種物品）等衛(wèi)生樣本，包括常規(guī)衛(wèi)生評價、公共衛(wèi)生事件、環(huán)境監(jiān)測、委托送檢等標本臨床各種感染材料（試劑、樣品、耗材、醫(yī)療廢棄物等）動物尸檢或感染材料。,4,二、采樣的一般原則（1）無菌原則采樣用具要無菌且在有效期內(nèi)；采樣操作程序要無菌；如果采樣部位需要經(jīng)過皮膚和粘膜時，做好外表面的消毒，防止污染。密封送檢（2）選擇正確的采樣時間分離病原菌時，應早期采樣；最好是病人發(fā)病早期、急性期或癥狀典型時；用藥前采樣，或停藥24h采樣，或下一次用藥前采樣用于血清學診斷時，急性期及恢復期采集雙份血清。,5,（3）選擇正確的采樣部位根據(jù)感染特點、病程發(fā)展及目的菌可能存在的部位，選擇合適的解剖部位采樣。（4）采集足夠量樣本采樣量不能太少，過少樣品會導致假陰性結(jié)果；衛(wèi)生樣本要具有代表性，否則會影響評價的準確性。（5）多樣性采集感染進程復雜的，應多部位或多時間段采樣，以防漏檢。（6）做好采樣記錄記錄樣本類別、采樣時間、地點、采樣量及采樣人等信息。,6,三、樣本送運原則（1）選擇適當?shù)臏囟群蜁r間送檢時間長或溫度高，菌相將發(fā)生改變，影響結(jié)果的準確性；應遵循盡快送檢的原則；常規(guī)細菌學檢查，不超過2h，最好1h內(nèi)，保存在4中不超過24h。含有腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等的樣品，低溫自溶，應在25常溫送檢或用便攜式培養(yǎng)箱送檢,7,（2）選擇正確的氣體環(huán)境針對厭氧菌樣本，注意隔絕空氣氧；如使用專門的厭氧采樣瓶或試管，或人為的排出空氣，或直接接種于厭氧培養(yǎng)基或放在厭氧袋、厭氧盒中（3）保持密閉狀態(tài),8,便攜式恒溫培養(yǎng)箱,便攜式冷藏保溫箱,厭氧培養(yǎng)袋,厭氧罐,厭氧瓶,9,第二節(jié)細菌的分離培養(yǎng)方法,細菌的分離培養(yǎng)提供細菌生長所需的各種條件（營養(yǎng)、溫度、濕度、酸堿度和氣體），從樣本中獲得該種細菌活的純化物的過程。主要內(nèi)容包括培養(yǎng)基制備、細菌接種方法、細菌培養(yǎng)方法、細菌的生長現(xiàn)象,10,11,一、培養(yǎng)基的制備,培養(yǎng)基是指經(jīng)人工配制，將供細菌生長繁殖需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)按比例配制而成的基質(zhì)，可用于細菌的分離純化、傳代、鑒定、菌種保存等。,12,（一）培養(yǎng)基的主要成分及其作用P261.營養(yǎng)物質(zhì)：碳源、氮源及其它營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖類、血液、雞蛋、動物血清、酵母粉、生長因子、無機鹽類）。2.水分：常用蒸餾水。3.凝固物質(zhì)：瓊脂、明膠4.抑制劑和指示劑：如膽鹽、抗生素、酸堿指示劑、氧化還原指示劑等。,13,（二）培養(yǎng)基制備的一般程序,調(diào)配,矯正pH,過濾澄清,分裝,滅菌,檢定,保存,稱量、溶解,氫氧化鈉、鹽酸（0.1mol/L、1mol/L）高出所需pH0.1-0.2個單位,先調(diào)pH，沸水加熱5-10min，冷卻后過濾；濾紙、絨布等過濾,液體：不超過容器2/3；斜面：1/管；半固體培養(yǎng)基：1/3管；高層斜面：1/41/3管；平板：1315ml,耐高壓：121，15min含糖：115，15min雞蛋、牛奶等：間歇滅菌3天3次不耐高溫的血清、尿素等：濾過除菌,外觀：完整性、水分浸入、色澤異常、培養(yǎng)基外溢、干裂等棄去。無菌試驗：放入361過夜，有菌生長棄去。功能檢查：標準菌株培養(yǎng)2448h，無菌或生長不好。重復接種結(jié)果仍同前，棄去。,冷藏，不宜過久。防止干涸、變質(zhì)和污染。,14,所用器材及過程,培養(yǎng)基、玻璃器皿天平、藥匙,15,以量筒裝取適當量蒸餾水于玻璃容器中于玻璃容器上標示培養(yǎng)基名稱,16,放上秤藥紙並歸零以秤藥匙舀出適當量藥品(請看培養(yǎng)基配方上說明),17,傾倒培養(yǎng)基時小心不要沾到玻璃壁上,18,清理配藥桌面與天平清洗秤藥匙，擦干放回藥品放回藥品柜,19,1.按物理性狀分類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基（瓊脂含量0.51%）固體培養(yǎng)基（瓊脂含量22.5%）,（三）培養(yǎng)基的種類,20,液體培養(yǎng)基,主要用于增菌培養(yǎng)、生化試驗等,21,制備平板、斜面、高層及高層斜面，用于細菌分離培養(yǎng)、鑒定和保存、増菌等。,固體培養(yǎng)基,22,觀察微生物的動力，分類鑒定、保存菌種以及噬菌體效價滴定等。,半固體培養(yǎng)基,23,2.按成分分類合成培養(yǎng)基由化學物質(zhì)和成分已知的各種物質(zhì)所組成，可以是無機鹽類，或無機鹽類加有機物質(zhì)。各批次性質(zhì)穩(wěn)定，用于細菌代謝、分類、菌種選育、遺傳分析等情況使用。天然培養(yǎng)基化學成分不完全清楚，各批物質(zhì)的成分很難一致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、雞蛋。成本較低，在細菌學研究中常用。,24,3.按用途分類（1）基礎培養(yǎng)基含有大部分細菌生長繁殖所需的最基本的營養(yǎng)成分。普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂、蛋白胨水等（2）營養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎培養(yǎng)基上加入葡萄糖、血液、血清等營養(yǎng)成分，以滿足對營養(yǎng)要求較高和需要特殊生長因子的細菌生長繁殖。血液瓊脂培養(yǎng)基、血清肉湯培養(yǎng)基、巧克力血瓊脂培養(yǎng)基。（3）增菌培養(yǎng)基在普通培養(yǎng)基中加入一些某種微生物特別喜歡的營養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，逐漸淘汰其它微生物。多為液體培養(yǎng)基，一般具有選擇性抑制作用的抑制劑。有助于目的菌的增殖,25,常用増菌培養(yǎng)基,26,（4）選擇性培養(yǎng)基多為固體培養(yǎng)基，加有抑制物質(zhì)，抑制其它非目的菌的生長或使其生長不佳。,27,常用的選擇培養(yǎng)基,28,（5）鑒別培養(yǎng)基利用各種細菌分解糖類和蛋白質(zhì)等的能力及其代謝產(chǎn)物的不同，在此類培養(yǎng)基中加入了某些特定的作用底物，用于檢查各種細菌的生化反應，以鑒別和鑒定細菌。,29,（6）厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)基氧化還原電勢低，有利于厭氧菌的生長。如庖肉培養(yǎng)基肉渣中含有谷胱甘肽