GB 5413.20-2013 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定

中華人民共和國國家標準0132013013本標準代替 997嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測定。本標準與 997相比，主要變化如下：修改了標準的名稱；修改了用于酶反應的顯色劑成分；增加了第二法雷氏鹽分光光度法。0131食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定1 范圍本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定方法。本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定。第一法 酶比色法2 原理試樣中的膽堿經酸水解后變成游離態(tài)的膽堿，再經酶氧化后與顯色劑反應生成有色物質，其顏色的深淺在一定濃度范圍內與膽堿含量成正比。3 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為6682規(guī)定的三級水。羥甲基氨基甲烷(酚(鹽酸 (氧化鈉(堿氧化酶：置于存。氧化物酶：置于28保存。11。脂酶D：置于存。酸(1 )：量取85 鹽酸(3 )：量取125 ）：1 蒸餾水定容至1000溶液在4冰箱中可保存一個月。于酶反應的顯色劑：取100120活力單位的膽堿氧化酶、250280活力單位的過氧化物酶、75個100個活力單位的磷脂酶D、15 0 用時配制。氧化鈉溶液(500g/L)：稱取500于水并稀釋至1000 準品膽堿酒石酸氫鹽標準品（純度99%。堿氫氧化物標準貯備溶液（稱取在1022烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽523蒸餾水稀釋至刻度。冷藏于42冰箱中，保存不超過1周。堿氫氧化物標準工作溶液（250g/水稀釋至刻度。臨用時配制。4 平：溫水浴鍋：溫度可控制在702和372。4.3 光光度計。5 體試樣稱取5 g（合均勻的試樣，于100 入30 ）。體試樣稱取20 g（合均勻的試樣，于100 入10 ）。解將裝有試樣的容器放在70水浴中，加塞混勻，水解3 h（每隔30冷卻。入50 蒸餾水定容至刻度。濾過濾水解液（濾液應是澄清的，否則，液放在4的冰箱中可以保存3 d。準曲線的制作分別吸取2 蒸餾水稀釋至刻度。準備6支試管，一個試管用作試劑空白（A），另五支試管由1至5編號，分別用于標準溶液和標準溶液的四個稀釋度。按表1加入試劑。0133表1 制作標準曲線時的試劑添加量 單位為毫升試劑 管A 管1 管2 管3 管4 管5稀釋度1/（50g/ 稀釋度2/（100g/ 稀釋度3/（150g/ 稀釋度4/（200g/ 標準溶液/（250g/ 發(fā)色劑 勻，把試管置于37水浴中保溫反應15 試樣的測定將每個試樣準備2支試管（B，C），按表2加入試劑。表2 測定試樣時的試劑添加量 單位為毫升試劑 試管管發(fā)色劑 勻。把試管置于37水浴中保溫反應15 比色測定將試樣及標準系列溶液從水浴中取出，冷卻至室溫。在波長505蒸餾水作空白，測定吸光值。以膽堿標準溶液的濃度為橫坐標，以標準溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標，制作標準曲線。6 吸光值的計算通常新鮮配制的試劑會產生輕微顏色，且由于水解作用濾液也不是無色的，為了除去這些干擾因素，應該從總吸光值中減去各自的空白值（管試樣凈吸光值計算如公式（1）所示： （1）式中：A 試樣凈吸光值；總吸光值（管C）；試劑吸光值（管A）；濾液吸光值（管B）。對于標準曲線，0。堿含量的計算在標準曲線上查出凈吸光值的位置，并記下相應的濃度c，以每100 ），單位為（00g），試樣中的膽堿氫氧化物含量按公式（2）計算：1000100 （2）式中：X試樣中的膽堿氫氧化物含量，單位為毫克每百克（00g）；c自標準曲線上查得的膽堿氫氧化物的濃度，微克每毫升（g/V水解液被稀釋的體積（通常為50單位為毫升（m 試樣的質量，單位為克（g）；1000換算系數(shù)。計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留整數(shù)位。7 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的8%。8 其他方法檢出限為1 00g，定量限為300g。第二法 雷氏鹽分光光度法9 原理試樣中的膽堿用氫氧化鋇弗羅里硅土層析凈化，與雷納克銨鹽溶液形成粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，用丙酮溶解洗脫，于526 一定濃度范圍內，膽堿雷納克銨鹽顏色的深淺與其含量成正比。10 試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為6682規(guī)定的三級水。羅里硅土：100目200目，650活化。醇（氯甲烷（氧化鋇H）28乙酸（酸甲酯（酮(納克銨鹽(和氫氧化鋇取6 放入超聲波中溶解后，加入10 勻。乙酸+10)：1體積冰乙酸與10體積甲醇混合。納克銨鹽溶液：入10 入超聲波中溶解后過濾，臨用時配制。準品膽堿酒石酸氫鹽(純度99%。準溶液配制膽堿酒石酸氫鹽標準溶液(1 g/L)：準確稱取在1022g，用蒸餾水定容至100藏于42冰箱中，保存不超過一周。11 平：流裝置：250溫水浴鍋：溫度可控制在792。析柱：長約10 徑1光光度計。12 樣制備稱取固體試樣10 g(稱取液體試樣20 g(磨口錐形瓶中，加入50 合均勻后接入回流裝置，于792的水浴鍋內水解抽提4 h。每隔1 避免試樣結塊。水解抽提結束后，取出錐形瓶冷卻至室溫，過濾。濾渣用冰乙酸次，洗液一并收集于100甲醇定容至刻度，混勻。析柱制備用乳膠管連接層析柱與滴頭，用少量脫脂棉堵住層析柱底部，倒入約5 甲醇浸濕，備用。析分別吸取膽堿標準溶液0 .0 .0 溶液完全進入柱床后，依次用5 0加入5適量的冰乙酸洗去過量的雷納克銨鹽，直至層析柱上無雷納克銨鹽附著處呈現(xiàn)硅土原有的白色。用丙酮洗脫粉紅色的膽堿雷納克銨鹽，收集于10丙酮定容（在波長526膽堿酒石酸氫鹽含量為橫坐標（吸光值為縱坐標繪制標準曲線。0136吸取10層析柱中，其余操作按照 標準曲線上查得103 分析結果的表述試樣中的膽堿以膽堿氫氧化物計，以毫克每百克（00g）表示，按公式（3）計算： x （3）式中：X試樣中膽堿氫氧化物的含量，單位為毫克每百克（00g）；m試樣的質量，單位為克（g）；V層析時吸取試樣水解液的體積，單位為毫升（從標準曲線上查得膽堿酒石酸氫鹽的含量，單位為毫克