動物實驗基本技術(shù)研究生課

毒理學(xué)實驗常用動物實驗技術(shù),毒理室2014年09月11日,第一節(jié)、動物實驗前的準備第二節(jié)、實驗動物的捉拿與固定第三節(jié)、實驗動物的麻醉第四節(jié)、供試品的給予方法第五節(jié)、各種檢驗標本的采集方法,第六節(jié)實驗動物的安死術(shù)第七節(jié)尸體檢查及臟器標本采集原則與檢查方法第八節(jié)實驗外科的基本操作技術(shù)第九節(jié)動物實驗中的安全防護第十節(jié)動物實驗后廢棄物的無害化處理,第一節(jié)動物實驗前的準備,一、動物實驗室的選擇二、實驗動物的購買三、實驗動物編號與標記,一、動物實驗室的選擇,1.根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的實驗室及飼養(yǎng)室。2.動物實驗室要與實驗動物同等級別。3.飼養(yǎng)室應(yīng)符合實驗動物的生活習(xí)性及國家實驗動物設(shè)施各項標準。,二、實驗動物的購買,1.應(yīng)購買有實驗動物生產(chǎn)供應(yīng)許可證的單位所生產(chǎn)繁殖的實驗動物，并應(yīng)索取相應(yīng)實驗動物的質(zhì)量合格證明。2.如果從外地購買的動物，應(yīng)考慮運輸中的各種因素對實驗動物的影響，并應(yīng)查閱運輸檢疫證明。3.購買的動物需要經(jīng)過3-7天的隔離檢疫、觀察。,三、實驗動物編號與標記方法,（一）染色法：1、單色涂染法：在每組動物不超過l0只或一個實驗不超過40只的情況下適用。實驗動物：大鼠、小鼠。常用染色劑：3-5苦味酸溶液，可染成黃色。,方法步驟：(1)涂染原則：從左到右、從上到下。(2)左前肢為l號、左側(cè)腹部2號、左后肢3號。(3)兩耳后部4號、背中部5號、后肢背部6號。(4)右前肢7號、右側(cè)腹部8號、右后肢9號。(5)尾巴根為10號。（6）額部為20號,2、雙色涂染法：在每組動物不超過100只的情況下適用。實驗動物：大鼠、小鼠。常用染色劑：(1)3-5苦味酸溶液，可染成黃色。作為“個”位數(shù)。(2)0.5%中性紅或品紅溶液，可染成紅色。作為“十”位數(shù)。,方法步驟：(1)用兩種顏色同時進行染色標記。(2)用苦味酸(黃色)染色標記作為個位數(shù)，個位數(shù)的染色標記方法同單色涂染法。(3)用品紅(紅色)染色標記作為十位數(shù)，,（4）左前肢為10號、左側(cè)腹部20號、左后肢30號，兩耳后部40號、背部50號、后肢背部60號，右前肢70號、右側(cè)腹部80號、右后肢90號第100號不作染色標記。,（二）穿耳孔法用專用耳空器在動物耳朵不同部位打一小孔或缺口表示一定號碼的方法，原則是：左耳代表十位，右耳代表個位。實驗動物：兔、犬、豬,（三）標牌法一般掛在動物的頸部、耳朵、腳上或?qū)嶒瀯游铮喝?、猴（四）烙印法（五）剪毛?第二節(jié)實驗動物的捉拿與固定,大小鼠的捉拿與固定豚鼠的捉拿與固定兔的捉拿與固定犬的捉拿與固定,一、小鼠的抓取保定：器材：小鼠飼養(yǎng)盒+面罩1套。方法步驟：1、用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部將小鼠提起，放在飼養(yǎng)合的面罩上。2、用左手拇指和食指迅速、準確地捏住小鼠的兩耳后及頸背部的皮膚，將小鼠提起。,3、翻轉(zhuǎn)左手掌，以左手掌心和中指夾小鼠背部的皮膚，使小鼠整個呈一條直線。4、用左手無名指壓住小鼠背部的皮膚，小指壓住小鼠的尾巴根部。5、松開捏住小鼠尾巴的右手拇指和食指。此法適用于肌注、腹腔注射、灌胃等,二、大鼠的抓取保定：,大鼠的抓取保定：器材：大鼠飼養(yǎng)盒+面罩1套。方法步驟：4-5周內(nèi)的大鼠，方法同小鼠。周齡較大的，則：1、首先戴好防護手套。2、用右手拇指和食指抓住大鼠尾巴中部將大鼠提起，放在大鼠飼養(yǎng)盒的面罩上。3、左手順勢按、卡在大鼠軀干背部，稍加壓力向頭頸部滑行。4、以左手拇指和食指捏住大鼠兩耳后部的頭頸皮膚，其余三指和手掌握住大鼠背部皮膚，完成抓取保定。,三、豚鼠的抓取保定,器材：大鼠飼養(yǎng)盒+帶面罩l套。方法步驟：1、先用左手輕輕扣、按住豚鼠背部。2、順勢抓緊其肩胛上方皮膚，拇指和食指環(huán)箍其頸部。3、用右手輕輕托住其臀部，即可將豚鼠抓取保定。抓豚鼠時，一般不要抓腰腹部位，否則易造成肝破裂而引起死亡。,四、兔的抓取保定：(一)方法1：步驟：1、用右手抓住兔頸部的被毛和皮膚，輕輕把兔提起。2、用左手托住兔的臀部。,(二)方法2：器材：兔保定架1個。步驟：1、打開保定架的上蓋，抓取并將兔放進架內(nèi)，迅速關(guān)上保定架的上蓋。2、右手抓住兔耳朵將頭部拉過保定架的卡栓，將兔的脖子保定。3、如果兔掙扎，可用手在它的背上輕輕撫摸，使其安靜。,五、犬的抓取與固定,用特制的長柄狗頭鉗夾住狗頸部，將其按在地，由助手用繩子將其四肢及嘴固定好。扎口時注意松緊，保證動物正常呼吸。,第三節(jié)實驗動物的麻醉,動物麻醉是消除動物手術(shù)疼痛，便于實驗操作，保證動物安全，為手術(shù)創(chuàng)造良好的條件。動物全身麻醉分四期：1.第一期：隨意興奮期，出現(xiàn)運動與運動失調(diào)；2.第二期：不隨意興奮期，由意識完全喪失至規(guī)則的自動呼吸開始時止。3.第三期：外科麻醉期，4.第四期：延髓麻醉期，進入此期，麻醉已嚴重過量。,麻醉方法與麻醉藥,麻醉方法：全身麻醉和局部麻醉，通過吸入、注射（靜脈、皮下、肌肉、腹腔）、口服、灌胃等方法使動物麻醉。常用麻醉藥物：乙醚（吸入），戊巴比妥鈉、硫賁妥鈉、氯胺酮（靜脈），普魯卡因、利多卡因（局麻），,常用麻醉藥的劑量及注射途徑,麻醉注意事項,麻醉前應(yīng)禁食8h以上麻醉前應(yīng)準確稱體重注意麻醉劑量麻醉過程中注意觀察動物的反應(yīng)情況注意保溫靜脈注射時必須緩慢，在寒冷冬季，麻醉劑在注射前應(yīng)加熱至動物體溫水平,第四節(jié)供試品給予方法,實驗動物常用的給藥方法有口服、注射、吸入等一、經(jīng)口給藥1.自動口服給藥：2.灌胃給藥:是借器械將藥物直接灌入動物胃內(nèi)的方法。此法可以準確控制給藥量，但如果操作不當易造成動物死亡。（1）大小鼠灌胃：,方法步驟：1、將灌胃針連接在注射器上，吸入一定量的藥液。2.操作前，大致量一下從口到胃的距離，估計灌胃針頭插入的深度。3.左手捉持動物，使頭部向上。3、右手持針，把灌胃針頭的前端放進動物的口腔，順著上腭部插入咽部，順咽后壁輕輕往下推，灌胃針會順著食管滑入動物的胃內(nèi)，此時沒有抵觸感。4、用右手食指將針栓慢慢往下壓，將注射器中的藥液灌入動物的胃中。,劑量：小鼠約0.1-0.5ml10g體重。最大體積為1.0ml/只大鼠約1-2ml100g體重，最大體積為4.0ml/只注意：在灌胃過程中，避免誤插入氣管。,（2）兔灌胃,原理：將藥液直接注入兔的胃內(nèi)。器材：兔開口器、14號胃管、注射器1支、生理鹽水、燒杯、石蠟油。,步驟：1、將兔放進保定架內(nèi)，助手用手輕輕壓住兔的背部，避免兔的掙扎。2、灌胃者用左手拇指和中指擠壓兔兩頰，將下頜擠開使兔被動張口。,3、右手將開口器從一側(cè)口角插入口腔并固定。4、用泡在石蠟油中的胃管，經(jīng)開口器的孔插入，向前推進約15cm，可達胃內(nèi)。,5、在插管時應(yīng)將胃管另一端泡在水中確認沒有冒氣泡，或胃管另一端接注射器，輕抽注射器，看有是否有胃液，檢驗是否插入胃，確認到胃，即可用注射器經(jīng)胃管注入藥液;灌胃量：80-150ml只次。注意：在灌胃過程中，避免誤插入氣管。,（二）注射給藥1、皮下注射給藥：原理：將藥液注入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環(huán)。器材：1m1注射器1支、生理鹽水、燒杯、酒精、碘酒、棉球。,方法步驟：(1)注射部位：頸背部、腋下、腹側(cè)和后肢的皮下(2)常規(guī)消毒注射部位的皮膚，用注射針頭取一銳角角度刺入皮下.(3)將針頭輕輕向左右擺動，易擺動則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢地將藥物注入皮下。注射量：0.1ml0.3ml10g體重。,2.皮內(nèi)注射,此法用于觀察皮膚血管通透性變化或皮膚反應(yīng)。注射部位：動物背部脫毛，用針頭平直進入皮內(nèi)，注射藥液后，皮膚表面鼓起小泡，停片刻拔出針頭。,3.肌肉注射給藥原理：將藥液注入動物的肌肉組織，經(jīng)毛細血管吸收進入血液循環(huán)。器材：1ml注射器1支、生理鹽水、燒杯、酒精、碘酒、棉球。注射部位：一般選擇肌肉豐富而無大血管通過的臀部或大腿外測，回抽無血即可注射。,4.腹腔注射,原理：將藥液注入小鼠的腹腔。器材：注射器1支、生理鹽水、燒杯、酒精、碘酒、棉球。,方法步驟：,(1)用左手將小鼠捉持保定，使鼠腹部朝上，鼠頭略低于尾部。(2)右手持注射器將針頭在下腹部靠近腹白線的兩側(cè)進行穿刺。,5.靜脈注射給藥（1)大小鼠尾靜脈注射原理：將藥液注入小鼠的尾靜脈。器材：1m1注射器1支、生理鹽水、燒杯、金屬籠或大小鼠器、酒精、碘酒、棉球。,方法步驟：(1)將大小鼠放在金屬籠或小鼠固定器中，通過金屬籠或大小鼠固定器的孔拉出鼠尾巴。(2)用左手捏住鼠尾巴中下部，用75酒精棉球反復(fù)擦拭尾部。,(3)注射時，以左手拇指和中指捏住鼠尾兩側(cè)，用食指從下面托起尾巴，以無名指夾住尾巴的末梢。(4)右手持4號針頭的注射器，使針頭與靜脈平行（小于30度角）。,(5)從鼠尾巴下14處進針，仔細觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管，即可注入藥物。(6)拔出針頭后，用干棉球壓住注射部位約l、2min，防止出血。注射量：小鼠0.05m10.1m110g體重。大鼠1.0-2.0m1100g體重,（2）兔耳緣靜脈給藥原理：穿刺兔的耳緣靜脈器材：兔保定架、注射器1支、生理鹽水、燒杯、酒精、碘酒、棉球。,方法步驟：(1)將兔放在保定架內(nèi)保定。(2)酒精消毒并揉搓血管，使兔的耳緣靜脈充盈。,(3)用左手食指和中指夾住兔的耳緣靜脈的近端，拇指繃緊靜脈的遠端，無名指和小指放在耳郭下作墊。(4)右手拿注射器，針尖的斜面朝上，將針頭從遠心端插入血管，放松對靜脈近心端的壓迫，回抽有血即可注射，拔針后用棉球止血。,（3）犬靜脈注射,注射部位:前肢靜脈、后肢小隱靜脈,6.腦內(nèi)注射：7.椎管內(nèi)注射：此法主要用于抽取腦腦脊液8.關(guān)節(jié)內(nèi)注射：9.淋巴囊注射：蛙類常采用此法,第五節(jié)各種檢驗標本的采集方法,一、采血1.尾巴尖采血：常用于大小鼠，小量采血?？梢远啻尾裳?.眼眶靜脈叢采血：常用于大小鼠、沙鼠的常規(guī)血液檢查。微量采血。3.摘眼球采血:血量較多，常用于大小鼠、沙鼠4.腹主動脈采血：常用于大小鼠、沙鼠，動物要麻醉后進行，用針管在腹主動脈分叉處，與血管平行刺入，此法采血量大。5.心臟采血：6.兔耳緣靜脈或耳中動脈、頸動脈采血7.犬在前肢靜脈、后肢小隱靜脈采血8.猴可在指尖、足跟、后肢皮下靜脈、頸靜脈采血9.豬小型豬為耳大靜脈、后肢靜脈,小鼠各種采血方法的最大采血量,剪尾巴采血：0.1ml/次，可以用溫水（50）浸泡幾分鐘或放恒溫箱幾分鐘，使其尾巴血管充盈，剪去尾巴1-2mm.摘眼球采血：0.1-0.6ml/次心臟采血：0.5-0.6ml/次斷頭采血：0.8-1.0ml/次眼眶靜脈叢采血：0.2-0.3ml/次，取內(nèi)徑為1.0-1.5mm的玻璃毛細管，臨用前折斷成1-1.5cm長的毛細管段，浸入1肝素溶液中，干燥后用。大鼠、豚鼠、兔均可采用此法。,二、采集體液,1.胸水的采集2.腹水的采集3.消化液的采集:主要有唾液、胃液、膽汁、胰液4.尿液的采集5.骨髓液的采集6.動物精液的采集7.乳汁的采集,尿液的采集,代謝籠法:此法較常用于大、小鼠，成熟小鼠尿量1-3ml/24h，大鼠為55-75ml/24h導(dǎo)尿法：常用于雄兔、犬等動物，要輕度麻醉，可以采到無污染的尿液。壓迫膀胱法：此法適用于兔、貓、犬等大動物。輸尿管插管法,膀胱插管法膀胱穿刺法剖腹采尿法反射排尿法：適用于小鼠。,三、采糞,大、小鼠：采用代謝籠兔：大量，采用代謝籠犬、猴、豬:采集自然排出的糞便。,第六節(jié)實驗動物的安死術(shù),實驗動物的處死必須遵循實驗動物的倫理要求和動物福利法按照人道主義原則處死實驗動物。一、“安死術(shù)”的概念：即安樂死術(shù)，是指以人道的方法處死動物過程。在處死動物的過程中盡量減少動物的驚慌、焦慮，使其安靜地、無痛苦地死亡。二、采用安死術(shù)必須符合的標準。,采用安死術(shù)必須符合的標準。,1.死時無驚恐、疼痛表現(xiàn)。2.使其在最短時間內(nèi)失去意識迅速死亡。3.方法可靠且可重復(fù)。4.對操作人員安全。5.采用的方法要與研究要求和目的一致。6.對觀察者和操作者的情緒影響最小。7.對環(huán)境的影響最小。8.需要的機械設(shè)備簡單、價廉、易操作。9.處死動物地點應(yīng)遠離并與動物房隔開。,安死術(shù)的常用方法,頸椎脫位法是將實驗動物的頸椎脫臼，斷離脊髓致死，為大、小鼠最常用的處死方法?？諝馑ㄈㄌ幩劳?、貓、犬常用此法，兔、貓為20-40ml,犬為80-150ml.過量麻醉處死此法多用于處死大鼠、豚鼠和家兔,吸入乙醚或腹腔注射巴比妥鈉。二氧化碳吸入法讓實驗動物吸入大量C02等氣體而中毒死亡。斷頭處死法、擊打頭蓋骨處死法,第七節(jié)尸體檢查及臟器標本采集原則與檢查方法,尸體的外部檢查技術(shù)尸體內(nèi)臟器官采集技術(shù)尸體內(nèi)臟臟器檢查技術(shù),第八節(jié)實驗外科的基本操作技術(shù),術(shù)前準備無菌技術(shù)手術(shù)的基本操作技術(shù)術(shù)后的動物護理與觀察,一、術(shù)前準備,1.手術(shù)室的要求與準備手術(shù)室的位置及設(shè)計原則、手術(shù)室的設(shè)備等2.動物準備3.手術(shù)器械、物品、敷料的準備,二、無菌技術(shù)：,是針對微生物及感染途徑所采取的一系列預(yù)防措施。包括滅菌、消毒法、操作規(guī)程及管理制度。,三、手術(shù)的基本操作技術(shù),1.手術(shù)器械的使用常用的手術(shù)器械是手術(shù)刀、手術(shù)剪、持針鉗、血管鉗、縫針等2.實驗外科的技術(shù)要求：穩(wěn)、準、輕、快。3.實驗外科的基本操作技術(shù):無菌、切開、止血、節(jié)扎、剝離、暴露、縫合。止血方法：壓迫止血、鉗夾止血、節(jié)扎止血、電凝止血、藥物止血。,四、術(shù)后的動物護理與觀察,