1.基因工程的工具.ppt

專題復(fù)習(xí),基因工程,生物組：劉婷,1.下列有關(guān)基因工程的敘述，正確的是A.基因工程培育作物新品種的原理是基因重組，而基因重組是隨機(jī)的，所以通過基因工程改造后的品種，不一定是人們需要的B.導(dǎo)入的目的基因能在受體細(xì)胞中成功表達(dá)，是因?yàn)椴煌虻目臻g結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成相同C.基因工程培育作物新品種不受生殖隔離的限制D.基因工程是在分子水平的操作，是人為增減或改變基因的某些堿基,C,一、概念,按照，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外等技術(shù)，賦予生物以，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。在水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，又叫DNA重組技術(shù)。,人們的愿望,定向,DNA重組和轉(zhuǎn)基因,新的遺傳特性,DNA分子,拼接基礎(chǔ),表達(dá)基礎(chǔ),打破物種界限,（基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)）生物體外基因DNA分子水平剪切拼接導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)人類所需要的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物定向改造生物的遺傳性狀,基因工程操作環(huán)境：操作對(duì)象：操作水平：操作過程：結(jié)果：實(shí)質(zhì)：,2、下列有關(guān)基因工程中工具酶的敘述，正確的是A.只能從原核生物中分離純化限制酶B.限制酶從識(shí)別的特定核苷酸序列中軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開，形成黏性末端C.DNA連接酶只能連接特定核苷酸序列的特定切點(diǎn)的磷酸二酯鍵D.在體外進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，可以用DNA連接酶代替DNA聚合酶,B,3、下列有關(guān)基因工程中載體的敘述，不正確的是A.除質(zhì)粒外，某些病毒也可以做載體B.載體必須能自我復(fù)制，有限制酶的切點(diǎn)，標(biāo)記基因可有可無C.基因工程中作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)?；A(chǔ)上人工改造的D.載體可將目的基因?qū)爰?xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核,B,1.限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”,來源：,能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂,形成DNA片段(限制酶切割DNA分子產(chǎn)生的DNA片段有兩種形式，即粘性末端和平末端),二、工具,主要從原核生物中分離純化得來,作用：,結(jié)果：,EcoR,Sma,2.DNA連接酶分子縫合針,將切下來的雙鏈DNA片段“縫合”，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵，拼接成新的DNA分子,E.coliDNA連接酶：只連接黏性末端,T4DNA連接酶：連接黏性末端和平末端但連接平末端的效率較低,是恢復(fù)被限制酶切開了的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，即作用于磷酸與脫氧核糖之間而不是堿基對(duì)之間的氫鍵,作用：,作用實(shí)質(zhì)：,基因工程使用的載體必須滿足的條件:,載體DNA能夠在受體細(xì)胞內(nèi)保存下來并大量復(fù)制,載體DNA必須有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn),載體DNA必須帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選,載體DNA必須是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害,載體DNA分子大小應(yīng)合適，以便提取和在體外進(jìn)行操作,將目的基因送入受體細(xì)胞中,主要來自細(xì)菌并進(jìn)行人工改造,3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”,作用：,來源：,載體的種類,質(zhì)粒、入-噬菌體和動(dòng)植物病毒,質(zhì)粒：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子,質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，常用大腸桿菌質(zhì)粒。質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無影響，復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成,1.2基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因的檢測(cè)與鑒定,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫：概念,2.基因文庫的分類:,種類,基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,3.獲取目的基因的根據(jù)：,某生物體內(nèi)全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,4.基因文庫的構(gòu)建方法,基因組文庫,某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA,cDNA,受體菌群體,部分基因文庫（cDNA文庫）,5.基因組文庫和部分基因文庫(cDNA文庫)比較,概念：PCR全稱為_，是一項(xiàng)在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),條件：_、_、_、_,原理：_,方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA雙鏈復(fù)制,已知基因的核苷酸序列（前提）,四種脫氧核苷酸,一對(duì)引物,耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增,(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從引物處延伸，合成與模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補(bǔ)配對(duì),四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個(gè)DNA分子,目的基因的mRNA,單鏈DNA(cDNA）,雙鏈DNA(即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,2）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測(cè),推測(cè),化學(xué)合成,1）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：,（三）人工合成的目的基因,思考：供體中哪些物質(zhì)能幫助我們獲取目的基因？,供體中：DNARNA蛋白質(zhì),目的基因,所有DNA,構(gòu)建,基因組文庫,獲取,所有RNA,構(gòu)建,cDNA文庫,目的基因的蛋白質(zhì),推測(cè),目的基因的核苷酸序列,人工合成,目的基因所在DNA,PCR擴(kuò)增,（引物）,目的基因的RNA,反轉(zhuǎn)錄,基因文庫,1、下列有關(guān)基因文庫的敘述中，說法正確的是A.可從人的基因組文庫中獲取胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，用來生產(chǎn)人的胰島素B.在人的一個(gè)cDNA文庫中，一定能找到胰島素基因C.真核生物和原核生物的cDNA文庫，均不含啟動(dòng)子D.根據(jù)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，不能從基因文庫中獲取目的基因,C,2、有關(guān)PCR技術(shù)，下列說法錯(cuò)誤的是A.PCR技術(shù)是利用DNA雙鏈復(fù)制的原理B.PCR擴(kuò)增目的基因的條件和體內(nèi)DNA復(fù)制相同C.PCR技術(shù)需要的兩種引物之間最好不互補(bǔ)D.PCR技術(shù)大量擴(kuò)增兩種引物之間的DNA序列,B,限制酶DNA連接酶載體,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,表達(dá)載體組成,所需工具,啟動(dòng)子終止子目的基因標(biāo)記基因,質(zhì)粒,DNA分子,限制酶處理,二個(gè)切口兩個(gè)黏性末端,四個(gè)切口獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種,過程:,DNA片斷RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì),終止子：DNA片斷能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄,標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。,構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：,啟動(dòng)子：,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,方法,植物細(xì)胞,動(dòng)物細(xì)胞,微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細(xì)胞,受體細(xì)胞,體細(xì)胞受精卵,受精卵,鈣離子處理,轉(zhuǎn)化：,目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,過程：,優(yōu)點(diǎn),（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,（2）基因槍法（3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法程序：,目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：,用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,3、下列有關(guān)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的敘述，正確的是A.T-DNA是Ti質(zhì)粒的標(biāo)記基因B.農(nóng)桿菌不易侵染單子葉植物，是因?yàn)閱巫尤~植物損傷后不分泌酚類化合物C.將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌的目的是篩選含目的基因的重組質(zhì)粒D.轉(zhuǎn)基因植物自交后代，均可表現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后的新性狀,B,鑒定（個(gè)體水平）,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,DNA分子雜交,分子雜交,抗原抗體雜交,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,檢測(cè)目的,分子水平,方法,供體獲取,用于制備,轉(zhuǎn)基因生物細(xì)胞中提取,轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),目的基因,目的基因,目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì),探針,探針,相應(yīng)抗體,所有DNA,所有RNA,所有蛋白質(zhì),歸納:基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（基因槍法、花粉管通道法）顯微注射法Ca2+處理目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：,4、科學(xué)家對(duì)一位缺乏腺苷酸脫氨酶（ada）基因而不能合成ada，患嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷癥的女孩進(jìn)行基因治療。方法是將患者的淋巴細(xì)胞取出做體外培養(yǎng)，然后用X病毒將正常ada基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞中，再將轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。據(jù)此回答：(1)可以根據(jù)ada基因的設(shè)計(jì)引物用于PCR擴(kuò)增a9da基因，PCR過程第一輪循環(huán)的模板是（該患者、正常人）的DNA。(2)X病毒的作用相當(dāng)于基因工程操作工具中的。用H和P限制酶切取ada基因，則所選載體上應(yīng)具有的酶切位點(diǎn)。,核苷酸序列,正常人,載體,H和P限制酶,4、科學(xué)家對(duì)一位缺乏腺苷酸脫氨酶（ada）基因而不能合成ada，患嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷癥的女孩進(jìn)行基因治療。方法是將患者的淋巴細(xì)胞取出做體外培養(yǎng)，然后用X病毒將正常ada基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞中，再將轉(zhuǎn)基因淋巴細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。據(jù)此回答：(3)目的基因的受體細(xì)胞是(體細(xì)胞、受精