細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù).ppt

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，主講人：貢曼基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究中心高格曼，本章內(nèi)容摘要，第一節(jié)顯微鏡第二節(jié)生化和分子生物學(xué)技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞雜交，第一節(jié)顯微鏡，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，-，光學(xué)顯微鏡，(a)普通光學(xué)顯微鏡，配置：照明系統(tǒng)光學(xué)放大系統(tǒng)機(jī)械裝置2。原理：通過物鏡形成倒置的真實(shí)圖像，通過目鏡放大為虛擬圖像。structureofmicroscope、lightpathwayofmicroscope、3。分辨率：指示區(qū)分對象最小間距的功能。光學(xué)顯微鏡的分辨率r=0.61 /n.a .其中是入射光波長。N.A .鏡像口速度=nsian/2；N=介質(zhì)折射率；=鏡子嘴(物鏡端口的示例角度)。顯微鏡的一些光學(xué)特性：介質(zhì)的折射率越接近透鏡玻璃(1.7)，越好；Sin/2的最大值小于1。鏡像口速度約為1.6。普通光線的波長為400到700nm，光鏡分辨率約為0.2m，人眼的分辨率為0.2mm，因此顯微鏡的最大有效倍數(shù)為1000X。(b)熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope，特征：光源為短波光；有兩個(gè)特殊過濾器。照明方法通常是自由落體表達(dá)式。fluorescent image，dnainbluandmicrotubulesingreen用于觀察引起熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察，基因定位，疾病診斷。(c)使用激光共焦掃描顯微鏡laserconfocusnningmicroscope、LCSM、激光作為照明，進(jìn)行逐點(diǎn)、逐行、逐面的高速掃描；可以顯示細(xì)胞樣本的三維結(jié)構(gòu)。分辨率是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似于熒光顯微鏡，但可以掃描不同的水平來制作立體圖像。LCSM、lcsmimageofaxenopusmelastohoremicrotuleocytoskeeton(green)和the nucleus (blue)，(4)深色視野顯微鏡dark fiels以比普通顯微鏡高50倍的分辨率觀察4200nm微粒子。(5)相位差顯微鏡是通過標(biāo)本的可見光的景象，將差異變更為振幅的差異，提高各種結(jié)構(gòu)之間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)清晰可見。結(jié)構(gòu)上相位差顯微鏡有兩個(gè)不同于普通光顯微鏡的特點(diǎn)。環(huán)形隔膜：在光源和電容器之間。相位板：物鏡添加了涂有氟化鎂的相位板，可以將直射光或衍射光的相位延遲到1/4 。原理，用途：觀察未染色幻燈片標(biāo)本。(6)極化顯微鏡下polarizingmicroscope檢測纖維絲、紡錘、膠原、染色體等雙折射物質(zhì)。進(jìn)入顯微鏡的光是偏振，鏡管有偏振器(垂直于偏振器方向的偏振板)。裝載空間可以旋轉(zhuǎn)。淀粉，(7)微分干涉差顯微鏡differentialinterpencecontrastricroscope(DIC)，1952年Nomarski設(shè)計(jì)了利用兩組平面偏振光的干涉來增強(qiáng)圖像的明暗效果，顯示結(jié)構(gòu)的三維投影。標(biāo)本可能稍厚，折射率差異更大，所以圖像的立體感更強(qiáng)。(8)倒置顯微鏡逆顯微鏡、物鏡和照明系統(tǒng)反轉(zhuǎn)；用來觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞通常有差異或DIC物鏡，也有熒光裝置。(9)現(xiàn)代顯微鏡的發(fā)展趨勢，結(jié)合一般光學(xué)顯微鏡、差異、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置；自動(dòng)化和電子。第二，電子顯微鏡，(a)透射電子顯微鏡透射顯微顯微鏡，tem，1。原理，電子束作為光源，電磁場作為透鏡。電子束波長與加速度電壓(通常為50120KV)的平方根成反比。包括電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5個(gè)部分；分辨率0.2納米，最高放大100萬倍；用于觀察微結(jié)構(gòu)(小于0.2米)。表2，其他光的波長，temlightpathway，transmission electric microscope，TEM，2。樣品制備技術(shù)，1)超薄切片超薄切片厚度約50納米，采用超薄切片器制作。通常是鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮分步脫水，環(huán)氧嵌入，熱膨脹或螺旋推進(jìn)的方式分割，重金屬(鈾，鉛)鹽染色。2)負(fù)染色技術(shù)，用磷鎢酸等重金屬鹽染色；吸干染料后，在樣品凹處鋪上一層重金屬鹽，凸起的地方?jīng)]有染料沉積，出現(xiàn)負(fù)染色效果，分辨率可能達(dá)到1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria，(2)掃描電鏡，20世紀(jì)60年代出來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)；掃描電子顯微鏡的有效比例為0.2mm/10nm=20000X，因?yàn)榉直媛蕿?至10nm，人眼分辨率(分辨熒光屏幕上最近的兩個(gè)光點(diǎn)的能力)為0.2mm。Scanningelectronmicroscope(SEM)，工作原理：用非常細(xì)微的電子束掃描樣品，在樣品表面產(chǎn)生二次電子，二次電子的量與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，二次電子由探測器收集，信號放大以調(diào)制熒光屏電子束的強(qiáng)度，顯示與電子束同步的掃描圖像。為了使二次電子在標(biāo)本表面發(fā)射，標(biāo)本被固定并脫水后，重金屬被電子束轟擊，發(fā)出二次電子信號的重金屬膜噴射一層。SEMLIGHTPATHWAY(人類紅細(xì)胞)、酵母、iii、micromanipulationtechnique(顯微解剖學(xué))是用顯微鏡操縱細(xì)胞或早期胚胎的方法之一。其中包括核移植、微注射、嵌合技術(shù)、胚胎移植、微切割等。核移植技術(shù)有幾十年的歷史。1952年，Briggs、King等將青蛙胚胎核注入細(xì)胞核的青蛙卵中，構(gòu)建了核移植胚胎。高唐(1962年)證明了原生胚胎后的核移植可以發(fā)展成成體。1997年，Wilmut等人克隆了楊多莉。微機(jī)械手，轉(zhuǎn)基因微工藝，第二節(jié)生化和分子生物學(xué)技術(shù)，第一節(jié)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色方法用于對特定細(xì)胞成分進(jìn)行定性和定位研究。(a)固定物理固定：血液膜空氣干燥、冷凍干燥?；瘜W(xué)固定：甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛、鋨酸等試劑。多糖一般使用乙醇固定，表明酶多使用甲醛丙酮緩沖液固定。(b)顯示方法，金屬沉淀法：磷酸水解酶分解磷酸基質(zhì)后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS著色沉淀，并顯示酶活性。席夫反應(yīng)：阿爾多能在席夫試劑中把無色紫紅色變成紅色。用來標(biāo)記糖和脫氧核糖核酸(Feulgen反應(yīng))。聯(lián)苯胺反應(yīng)：H202的過氧化物分解。將無色苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍(lán)，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)化為褐色化合物的新氧氣。脂質(zhì)溶解染色：用蘇丹染料溶于脂質(zhì)，使脂質(zhì)明顯。茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。第二，免疫細(xì)胞化學(xué)免疫細(xì)胞化學(xué)免疫系統(tǒng)是利用抗體與特定抗原特異性結(jié)合的原理確定抗原位置的技術(shù)。常用的標(biāo)記是路西法和酶。免疫熒光法：isothiocyanate fluorescein、rhodamine等。酶免疫測定法：如辣根過氧化物酶。第三，用于研究身體、組織和細(xì)胞中標(biāo)記化合物的分布、定位、排放和合成、更新、作用機(jī)制、作用部位等的輻射磁顯影。原則：將標(biāo)記為放射性同位素的化合物引入生物體內(nèi)，經(jīng)過一定時(shí)間后制作切片，鹵化銀乳膠，使其暴露在放射性中，使乳膠感光。通常表示為14C和3H。DNA是3H-TDR，RNA顯示為3H-UDR。用3小時(shí)氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3小時(shí)甘露糖，3小時(shí)巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。第四，具有分子雜交技術(shù)、互補(bǔ)核苷酸序列的兩個(gè)單鏈核苷酸分子片段在適當(dāng)條件下通過氫鍵形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雜交雙鏈分子。該技術(shù)可用于測定單鏈分子核苷酸序列之間的互補(bǔ)關(guān)系。(a) insituhybridization。在染色體上檢測特殊的DNA序列。起初使用放射性DNA探針，后來發(fā)明了免疫探針方法。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片，(2)南方雜交是體外分析特定DNA序列的方法，用限制性內(nèi)切酶將細(xì)胞核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，通過凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜，通過探針進(jìn)行雜交將RNA傳輸?shù)侥z片并通過探針雜交稱為Northern hybrid。六、PCR技術(shù)，PCR: polymerasechainreaction。反應(yīng)系統(tǒng)：樣品DNA；引物，約15-20個(gè)核苷酸；4種dNTP；來自熱熱水桿菌Thermusaquaticus的TagDNA聚合酶。最佳作用溫度為75 80 ，短時(shí)間不喪失95 的活性。緩沖系統(tǒng)和Mg2。反應(yīng)過程：變性：約90-95；復(fù)性：約60；延長：70-75；重復(fù)變性里折疊擴(kuò)大過程20-30次。三節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)，1，離心技術(shù)是細(xì)胞器官及各種大分子分離的基本手段。轉(zhuǎn)速10-25 kr/min的離心機(jī)稱為高速離心機(jī)。轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89Kg稱為超速離心機(jī)。超速離心機(jī)的最大速度達(dá)到10000 r/min，離心力超過500公斤。(a)差分離心Differentialcentrifugation，特征：介質(zhì)密度均相同；速度從低到高，離心。用途：分離差異很大的細(xì)胞和細(xì)胞器官。沉淀順序：核線粒體溶酶體和過氧化物酶體細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高基質(zhì)核蛋白體?？梢猿醪椒蛛x小器官，經(jīng)常需要通過密度梯進(jìn)一步分離和純化離心力。低速度，高速度，差異中心，(2)密度梯度離心，在通過離心力、離心力場分層、分離、分離細(xì)胞和細(xì)胞成分的離心管內(nèi)，使用介質(zhì)頂部的細(xì)胞懸浮，形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度類型：速度結(jié)算，等密度結(jié)算。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、蔗糖多聚。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：1)可以生成密度梯度，密度高的話粘度不高。2)PH中性或中性；3)濃度大時(shí)滲透壓力不大。4)對細(xì)胞無毒。第二，流式細(xì)胞術(shù)，用途：單個(gè)細(xì)胞快速定量分析和分類技術(shù)。原理：包裹在外皮中的細(xì)胞通過由高頻振動(dòng)控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射和熒光，由探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，發(fā)送到計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，根據(jù)這些特性選擇純度可高達(dá)99%的細(xì)胞子集。胞接細(xì)胞的流動(dòng)稱為鞘液體，使用的儀器稱為流式細(xì)胞系。第三，細(xì)胞電泳，原理：細(xì)胞表面在一定PH值下有凈正電荷或負(fù)電荷，可以在外部電場作用下游動(dòng)。由于各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞的充電量不同，在一定的電場內(nèi)游泳速度也不同。用途：檢測細(xì)胞的生理狀態(tài)，分離出不同種類的細(xì)胞。四節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞雜交，1，細(xì)胞培養(yǎng)，(1)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，集體培養(yǎng)：將包含一定數(shù)量細(xì)胞的懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞附著在墻上生長，合流后形成均勻的單細(xì)胞層。Clonalculture:培養(yǎng)高度稀釋的細(xì)胞懸浮，細(xì)胞附著生長，每個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞聚集，這稱為克隆。組培養(yǎng)(左)和克隆培養(yǎng)(右)，原代培養(yǎng)(primaryculture):即培養(yǎng)出動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞群。將細(xì)胞移植到新容器中，稱為通過或通過培養(yǎng)，每一代分裂約3-6次。細(xì)胞株：原代培養(yǎng)細(xì)胞的成功傳代是細(xì)胞株。細(xì)胞株：一組有特定特性或標(biāo)記的細(xì)胞，從培養(yǎng)細(xì)胞中篩選出來?？寺。阂卜Q為克隆。是指同一祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。，表3，實(shí)驗(yàn)室中常用的多個(gè)細(xì)胞株，Henrietta lacks，American black，dieddofcancerofulinecervixin 1951，ii，細(xì)胞融合，培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞一個(gè)雙核或多核同核體：同基因型細(xì)胞融合而成。雙核體：細(xì)胞融合的不同基因型。自發(fā)融合：同種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中