光敏劑的結構與性質

生命科學與工程學院實驗報告目錄0前言理想光敏劑的結構特征和光敏性質1抗菌光敏劑的分類及應用2實驗部分2.1實驗一2.2實驗二3展望0前言光動力療法( photodynamic therapy，PDT) 是利用光敏劑( photosensitizer，PS) 在異常組織選擇性聚集，在分子氧的參與下，由特定波長的光激發(fā)產生活性氧( reactive oxygen species，OS) ，并發(fā)生一系列光化學反應，對異常組織進行選擇性殺傷的一種疾病診療新技術。由于抗生素的濫用，耐藥微生物菌株數(shù)目正以驚人的速度增加，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 ( methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MSA) ，耐萬古霉素糞腸球菌( vancomycin-resistant enterococci，VE) ，耐多藥分枝桿菌和真菌等1。因此，探索新的抗微生物治療方法迫在眉睫。光動力抗菌化學療法( photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT) 作用機制與 PDT 相似，可用于滅活微生物，并已成為當前微生物耐藥情況下一種可選擇的抗病原微生物新方法。光動力抗菌化學療法機制尚不明確。目前認為光敏劑的光動力殺傷作用主要包括 I 型和型兩種機制: I 型機制是指光敏劑的三重態(tài)氧與底物發(fā)生電子轉移，產生自由基或自由基離子，進而對細菌產生氧化損傷和殺滅作用。型機制是指光敏劑的三重態(tài)氧與基態(tài)分子氧發(fā)生能量傳遞產生單重態(tài)氧，這些單重態(tài)氧與鄰近生物分子發(fā)生反應以造成損傷。一般認為 PACT 作用于微生物是多靶點，但主要是破壞細胞的外部結構，從而破壞細胞的新陳代謝。PS 不像傳統(tǒng)抗生素需要到達微生物細胞特定部位、與相應的結構粘附、結合及發(fā)生化學反應，因此，微生物通過阻斷或減少吸收、增加代謝及藥物排泄而產生抵抗的概率很低2，3。理想 PS 屬性包括: ( 1) 化學組分單一、結構明確且性質穩(wěn)定; ( 2) 在光照時具有強的光毒性，對機體無副作用，安全; ( 3) 可以快速從皮膚和黏膜清除; ( 4) 單態(tài)氧及其它活性氧物質產量高; ( 5) 較長波長的光激發(fā); ( 6) 合成工藝簡單、價格低廉; ( 7) 水中、注射液中和血液替代品中具有高溶解性。理想光敏劑的結構特征和光敏性質單線態(tài)氧在細胞質中的擴散范圍局限于 45nm 之內，所以光線的組織穿透深度對光動力治療是非常重要的因素，組織的增加和吸收波長的減少都將影響光的吸收和分散。組織吸收成分包括核酸、氨基酸、血紅蛋白和黑色素等，對于核酸和氨基酸，它們的吸收波長通常在 250 300nm 之間，所以它們對于波長大于 600nm 的光的吸收作用很小。大多數(shù)組織的吸收本質是由血紅蛋白控制的，而血紅蛋白的最強吸收峰出現(xiàn)在波長小于 620nm 處2。隨著波長從 620nm 增加至 800nm，這些吸收峰的增長很弱。其他的內源性發(fā)色基是黑色素，它是由酪氨酸分子凝結而成的聚合物，并在 400 700nm 區(qū)間均有吸收，但對較長波長的吸收相對減少。以上所有因素提供一個事實，小于 550nm 波長的光穿透力很低，而在 550 630nm 穿透力則成倍增長，當達到 700 800nm 后，對組織的穿透能力大幅度提升。然而，波長大于 800nm 的結果卻不能令人滿意。如果吸收波長太長( 大于 800nm) 則難于滿足形成1O2 的能量要求，意味著光子沒有足夠的能量使處于三線態(tài)的光敏劑將基態(tài)氧分子激發(fā)到單線態(tài)。而且，當波長增加時，化合物對光的穩(wěn)定性通常也會減弱。因此，理想的光敏劑應該在 660 800nm 之間( 即“治療窗口”) 有強吸收。由于 660 800nm 的光提供了最佳的組織穿透強度以及充分的能量來形成單線態(tài)氧，發(fā)展具有這一范圍波長吸收的光敏劑是光動力療法中的研究重點。波長較長的光可增加穿透深度，這是發(fā)展具有這種吸收波長光敏劑的主要原因，萘酞菁( 776nm) 和細菌葉綠素( 780nm) 的最大吸收波長都在治療窗口內。然而，光敏劑本身的光吸收可以限制組織光穿透，這種現(xiàn)象被稱為光敏劑的“自屏蔽”。如果光敏劑對治療波長的光具有非常強烈的吸收則其自屏蔽現(xiàn)象尤其明顯。許多光敏劑在暴露于光時容易發(fā)生稱之為光漂白的光破壞過程，而不同化學結構的光敏劑具有變化多端的光漂白率。所以，PDT 中應用的光敏劑應該足夠穩(wěn)定以避免諸如光漂白的降解過程3。優(yōu)秀的光敏劑分子應該具有良好的水脂溶性; 具有兩親性的藥物分子有利于藥物透過細胞膜。光毒性高而暗毒性低的光敏劑也是保證正常組織免受損傷的一個方面，可提高 PDT 治療的選擇性。PDT 之所以優(yōu)于其他腫瘤治療方法，一個重要原因就在于所用光敏藥物在無光照時具有低水平的暗毒性，而在對靶組織進行選擇性光照時，靶組織內的光敏劑被激活而選擇性地作用于靶組織。PDT 光敏劑在患者體內的藥代動力學消除應該迅速，以縮短治療后避光保護的時間和避免長時間的皮膚光敏性。它們應該對紅外或遠紅外區(qū)的光具有強烈吸收，以使 PDT 的治療作用可以到達盡可能深的部位，而且所使用的光不會導致正常組織光敏化。1抗菌光敏劑的分類及應用1.1卟啉類化合物卟啉類化合物具有相對較高的活性氧產量，是常用的 PS 之一，但它持續(xù) 4-6 周左右的暗毒性作用限制了它的廣泛應用。因此，近年來研究者們一直致力于開發(fā)更理想的卟啉類 PS。5-氨基酮戊酸 ( ALA) 作為一個典型的卟啉類 PS，本身不具備光化學反應特性，但可生物合成原卟啉 IX( PpIX) 的前體。PpIX 能迅速從身體清除，所以暗毒性作用時間減少。研究發(fā)現(xiàn) ALA 介導 PACT 具有廣譜的抗微生物效應4，因此 ALA 介導的 PACT 廣泛應用于皮膚病治療，如細菌、真菌及病毒感染等。但所有有核細胞都能夠利用 ALA 合成 PpIX，因而與其他 PS 相比，它的選擇性低; 另 ALA 介導 PACT 光照時疼痛感強烈。其他光敏劑，像帶陽離子卟啉化合物可以作為廣譜抗菌 PS，對耐甲氧西林金黃色葡萄菌、表皮葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的殺傷效果。光敏素 ( photofrin) 介導 PACT 能殺滅 MSA 感染關節(jié)炎小鼠模型的 MSA5。Photogem 介導的 PACT 能殺滅熱帶念珠菌和都林柏菌6。除了這兩種真菌以外，有報道稱 Photogem 介導的 PACT 還能完全殺滅口腔中白念珠菌、克魯斯氏念珠菌和光滑念珠菌7。1.2細菌葉綠素衍生物細菌葉綠素衍生物激發(fā)光波長為 700 900 nm，可以作為 PDT 和 PACT 的光敏劑。細菌葉綠素衍生物介導 PACT 對真菌、革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有一定效果，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌8。1.3酞菁及衍生物酞菁及其衍生物的激發(fā)波長為 670 780 nm。金屬離子修飾酞菁類化合物后具有活性氧產率高、持續(xù)時間長等特點，它介導的 PACT 對金黃色葡萄球菌有殺滅作用，且未發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對 PACT 抵抗9。金屬離子修飾酞菁類化合物介導 PACT 也能有效處理局部感染 MSA 小鼠模型的 MSA10。還有研究指出鋅修飾酞菁類后介導的 PACT 能夠有效殺滅革蘭氏陰性大腸桿菌。1.4天然光敏劑及衍生物天然光敏劑及其衍生物具有高效低毒的特點，因此備受青睞。目前主要有 4 大類: 姜黃素類、核黃素類，醌類化合物和補骨脂素類。141 姜黃素類姜黃素具有廣泛的藥理、毒理作用，在醫(yī)學多個領域均有應用，包括抗癌、抗炎和抗感染。姜黃素介導 PACT 副作用小，抗菌效果良好，因此臨床應用潛力強。它被 455 nm LED 激發(fā)且能在 30 min 內殺滅念珠菌11; 在藍色 LED( = 420 20 nm) 設備照射 4 min 后可以殺滅變形鏈球菌12。在體外實驗中姜黃素介導 PACT 能夠殺死齲齒中的細菌13。142 核黃素核黃素有兩個光吸收峰，分別在紫外光區(qū) 360 nm 和藍光區(qū) 440 nm。當核黃素被藍光激發(fā)時能殺死金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌14，主要應用于淺表感染治療。143 醌類化合物醌類光敏劑是帶有擴展-電子系統(tǒng)的化合物，在光和氧的作用下呈現(xiàn)細胞毒性。醌類化合物具有良好的光敏性質，可被紅外光激發(fā)( 激發(fā)波長為 540 610 nm) ，單線氧產率高。金絲桃素( hypercin) 是中性的疏水性化合物，一直作為一種抗癌 PS 進行研究較多。金絲桃素經修飾增加其水溶性也可介導 PACT 殺滅革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌，但對革蘭氏陰性大腸桿菌無明顯作用15。另外，醌類化合物中的竹紅菌素( hypocrellin) 和竹紅菌素 B( hypocrellin B) 作為 PS 其抗癌效果比抗菌效果好。尾孢菌素( cercosporin) 盡管活性氧產率高，但是抗微生物作用弱。1.4.4 補骨脂素補骨脂素類光學毒性機制主要包括兩個方面: 核酸中鳥嘌呤核苷的羥基化，此反應通常以單線氧為中介; 與病毒的核酸形成復合物，從而使病毒失活。補骨脂素類介導的 PACT 對病毒都有一定滅活作用16。1.5亞甲藍和吩噻嗪類化合物亞甲藍( MB) 已經在臨床上作為光敏劑( max = 660 nm) 使用。MB 介導 PACT 能殺滅口腔念珠菌病; 且 MB 介導 PACT 能增加念珠菌細胞膜的滲透性，進而增加其對抗生素的敏感性。MB 介導 PACT 還可殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，且副反應輕17。甲苯胺藍( TBO) 介導 PACT 對葡萄球菌有明顯的殺傷作用18。在體內研究中，TBO 介導 PACT 可明顯殺滅創(chuàng)傷動物模型的創(chuàng)傷弧菌19。新亞甲基藍( NMB) 介導 PACT 治療念珠菌感染小鼠以及多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的燒傷小鼠，結果顯示均有一定治療效果20，21。1.6其他合成染料光敏劑四碘熒光素是一種已經批準作為食品色素的碘化氧雜蒽染料。四碘熒光素易與細菌生物膜結合，在口腔科使用較多。四碘熒光素介導 PACT 比光敏素( photofrin) 、亞甲藍( MB) 對變異鏈球菌更有效。四碘熒光素介導 PACT 處理口腔念珠菌感染可以顯著減少粘附在上皮細胞的酵母菌和念珠菌，并且不損害正常組織22。吲哚菁綠( ICG) 主要用作造影劑。ICG 也可作為抗菌 PS，它能被 810 nm 二極管激光激發(fā)，它介導 PACT 能殺滅野生型和耐藥株金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌23。方酸菁及其衍生物在體外具有良好光動力性質。近年來，方酸菁及其衍生物 PDT 抗腫瘤方面研究較多。1.7新型納米光敏劑近些年來，納米粒子廣泛使用，由于它可提高光化學效率，因此 PDT 可與納米技術結合，達到更好的治療效果。納米醫(yī)學材料可以作為藥物載體，優(yōu)化藥物輸送，防止 PS 過早釋放和失活，改善藥物動力學，增加滲透率，提高藥物在靶 組織的濃度，減輕毒副反應，提高生物利用度24，且納米粒子能偶聯(lián)多種官能團，發(fā)揮多種功能，如顯像劑，靶向治療等。1.7.1富勒烯富勒烯是碳原子獨特排列的球形結構，廣泛應用于生物醫(yī)學領域。富勒烯超氧離子產率高，但因為吸收峰傾向于藍綠光波長，它的穿透能力差，水溶性也差，因此在淺表感染如燒傷、創(chuàng)傷應用較多。通過化學修飾富勒烯水溶性得到改善、生物相容性也有所加強，產生活性氧的能力得到提高，但是激發(fā)光波長和生物降解問題仍限制了其臨床應用。富勒烯衍生化合物介導 PACT，發(fā)現(xiàn)對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌甚至對真菌都有殺滅效果。且富勒烯類化合物介導 PACT 對真菌更具有殺傷作用，這可能與細菌、真菌細胞壁差異有關25。1.7.2碳納米管目前碳納米管的基本分兩類: 多壁型和單壁型。碳納米管具有高縱橫比( 長度比直徑) 和大表面積質量比，廣泛應用于凈化空氣和水。多壁型碳納米管衍生物具有強大的氧化作用，可用于消毒。研究發(fā)現(xiàn)卟啉共價修飾多壁型碳納米管被激發(fā)后顯著降低甲型流感病毒感染哺乳動物細胞的能力26。1.7.3石墨烯石墨烯是碳原子雜化結構。石墨烯衍生物具有良好的水溶性及生物相容性，可以封載大量疏水性藥物。石墨烯衍生物被綠色激光( 470 nm，1 W) 激發(fā)產生活性氧，可殺死耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和大腸桿菌27。1.7.4 脂質體脂質體是一種球形納米囊泡，疏水中心可以容納疏水性藥物或 PS，而親水性中心或核心可以容納水溶性藥物或 PS，是研究較廣泛的膠體運載工具28。脂質體封裝后，PS 的細胞吸收機制有兩種:1、與細胞膜融合后釋放內容物到胞質; 2、吞噬細胞吞噬、代謝脂質體，從而將活性藥物釋放到細胞。使用脂質體可以顯著改善 PDT 和 PACT 的療效和安全性。有研究指出脂質體介導的 PACT 可有效治療深部感染。脂質體可以包埋熒光劑使得 PACT 在缺乏傳統(tǒng)光源條件下可以激活 PS，進一步促進 PACT 治療深部感染的發(fā)展。脂質體最大的缺陷是不僅可以被微生物吸收也可以被正常組織細胞吸收，陽離子脂質體更容易與帶負電荷的哺乳動物宿主細胞的細胞膜融合。1.7.5二氧化鈦( TiO2) 化合物二氧化鈦半導體化合物毒性低，穩(wěn)定。納米二氧化鈦對感染魚類細菌具有很強的殺菌作用，且能增強魚類中性粒細胞對細菌的殺滅作用，因此，推薦水魚農場在飼料中添加納米二氧化鈦，防止或減少魚類細菌疾病的發(fā)生29。二氧化鈦納米顆粒能被自然光或紫外線激發(fā)，當二氧化鈦納米顆粒被小于 385 nm 的紫外線激發(fā)，可以高效產生活性氧，能殺死腫瘤細胞、細菌、真菌等。二氧化鈦化合物介導 PACT 也能殺滅芽孢桿菌孢子、炭疽桿菌毒素，甚至能滅活耐抗生素細菌: 像耐甲氧西林金黃色葡萄球菌( MSA) ，多重耐藥鮑曼不動桿菌( MDAB) ，耐萬古霉素大腸菌( VE) ，包括生物膜30。經化學修飾后的二氧化鈦具有更強的抗菌作用。二氧化鈦納米粒子因其抗感染性強等優(yōu)勢正被研究應用于醫(yī)學植入物表面31 。1.7.6金 Au 和銀 Ag 納米粒子金( Au) 納米粒子有良好的生物相容性，也可以像其他納米材料一樣作為藥物運載輸送工具，使其在生物體中廣泛使用。金納米粒子已被證明對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，耐萬古霉素的腸球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌及流感病毒均可達到良好殺傷效果。銀與生物分子中硫磷原子有較高的親和力，因而銀納米粒子可以與細胞膜中含硫氨基酸反應導致細胞死亡。低濃度狀態(tài)下，比起金或鋅納米粒子，Ag 納米顆粒對變異鏈球菌的殺滅效果更強32。Ag 納米顆粒還對 HIV、流感病毒、單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒和猴痘病毒、及真菌等都有一定殺傷能力。另外，其他納米材料，像高分子聚合物納米粒子、二氧化硅硅納米粒子、磁性納米粒子、稀土納米轉換發(fā)光材料都有進行 PDT 的相關研究。2實驗部分2.1實驗一脫鎂葉綠素的制備2.1.1原理對粗提取的葉綠素a反應制備脫鎂葉綠素a；2.1.2實驗過程稱取200 g糊狀葉綠素溶于600 mL乙醚，將該混合溶液加入到2000 mL圓底燒瓶內，0 下攪拌20 min后，緩慢加入800 mL 36%濃鹽酸。在0-4 條件下攪拌2.5 h 后,倒入分液漏斗中靜置，得到下層酸液，加冰水1000 mL左右稀釋,用NaOH調節(jié)pH至中性（pH值5-6），抽濾，干燥得濾餅粗產品黑色固體脫鎂葉酸a。粗產品，用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷 甲醇( 1000 1003) 洗脫，得到粗品，再用中壓制備色譜純化，得 4 8 g 黑色固體脫鎂葉綠酸 a，收率 2 4% 。2.1.3實驗結果 圖1: 脫鎂葉綠素實驗組與標準組點板對照圖從圖1可以看出，左邊的實驗組部分與右邊的標準組部分在約1.5cm處具有相似的成分，即脫鎂葉綠素，由此可以證明已經成功制取出脫鎂葉綠素，次實驗結果可用于實驗二繼續(xù)制備二氫卟吩e6。2.2實驗二、二氫卟吩e6的制備2.2.1原理2.2.2實驗過程20g脫鎂葉綠酸a溶于100 mL甲醇溶液中。將此混合溶液逐滴加入到300 mL 25%（75g KOH）氫氧化鉀乙醇溶液中回流攪拌。用2 mol/L的稀鹽酸調節(jié)pH至5-6，抽濾、干燥得濾餅二氫卟吩e6粗品.2.2.3實驗結果圖2二氫卟吩e6試驗樣品與標準樣品正向點板圖左和反向點板圖右圖從圖2中可以看出，左側的正向點板圖實驗樣與標準樣具有相同的顏色和范圍分布，右側的反向點板圖在在約7cm處具有相同的顏色分布，其他稍有差別的可能是因為粗提取樣品中存在些許雜質，總的來說，從圖中可以得出成功制備出二氫卟吩e6。3展望多重耐藥微生物數(shù)量的增加，成為臨床棘手問題之一。PACT 被認為是一種有效的微生物感染替代治療，但目前臨床應用仍有限。隨著物理、化學等交叉學科的發(fā)展，實驗條件的優(yōu)化以及抗菌 PACT 機制的闡明，開發(fā)具有多種功能的新型光敏劑無疑是 PACT 未來發(fā)展方向之一。我們相信，隨著更多新型光敏劑的研究開發(fā)，激發(fā)器的進一步完善以及臨床經驗的不斷積累，PACT 在治療微生物感染，特別是多重耐藥細菌感染領域的應用將會越來越得到重視。4參考文獻1 NICOLAU D P Current challenges in the management of the infected patientJ Curr Opin Infect Dis，2011，24 Suppl 1: S1-102 ALMEIDA A，F(xiàn)AUSTINO M A，TOME J P Photodynamic inactivation of bacteria: finding the effective targetsJ Future Med Chem，2015，7( 10) : 1221-12243 AWAD M M，TOVMASYAN A，CAIK J D，et al Important cellular targets for antimicrobial photodynamic therapyJ Appl Microbiol Biotechnol，2016，100( 17) : 7679-76884 HAIS F，PIEPOINT L Photodynamic therapy based on 5aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agentJMed es ev，2012，32( 6) : 1292-13275 TANAKA M，KINOSHITA M，YOSHIHAA Y，et al Photodynamic therapy using intra-articular photofrin for murine MSA arthritis: biphasic light dose response for neutrophil-mediated antibacterial effectJ Lasers Surg Med，2011，43( 3) : 221-2296 DOVIGO L N，PAVAINA A C，IBEIO D G，et al Photodynamic inactivation of four Candida species induced by photogem( ( ) ) J Braz J Microbiol，2010，41( 1) : 42-497 IBEIO D G，PAVAINA A C，DOVIGO L N，et al Photodynamic inactivation of microorganisms present on complete dentures a clinical investigation Photodynamic disinfection of com-plete denturesJ Lasers Med Sci，2012，27( 1) : 161-1688張丹萍 光動力新藥四吡咯化合物的設計與合成研究D上海:東華大學碩士學位論文，20099陳慧慧 二氫卟吩類衍生物的合成及其在光動力學療法中的應用J 安徽醫(yī)科大學學報，2013，48(6):717 72010 VECCHIO D，DAI T，HUANG L，et al Antimicrobial photodynamic therapy with LP068 kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus and improves wound healing in a mouse model of infected skin abrasion PDT with LP068 /Cl in infected mouse skin abrasionJ J Biophotonics，2013，6 ( 9 ) : 733-74211 DOVIGO L N，PAVAINA A C，IBEIO A P，et al Investigation of the photodynamic effects of curcumin against Candida albicansJ Photochem Photobiol，2011，87( 4) : 895-90312 PASCHOAL M A，LIN M，SANTOS-PINTO L，et al Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED deviceJ Lasers Med Sci，2015，30( 2) : 885-89013 AAUJO N C，F(xiàn)ONTANA C ，BAGNATO V S，et al Photodynamic effects of curcumin against cariogenic pathogensJPhotomed Laser Surg，2012，30( 7) : 393-39914 THAKUI P S，JOSHI ，BASNET S，et al Antibacterial photodynamic ther