細胞遷移和侵襲實驗技術.ppt

腫瘤細胞運動實驗技術,腫瘤細胞生物學實驗室張寧PI組,腫瘤細胞運動常用研究方法,Textinhere,侵襲實驗,趨化運動,實驗原理細胞劃痕法是測定了腫瘤細胞的運動特性的方法之一。在體外培養(yǎng)的單層細胞上，劃痕致傷，然后在加入藥物等實驗條件下觀察其對腫瘤細胞遷移的影響。,劃痕實驗（傷口愈合實驗，ScratchAssay）,操作步驟,1先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔0.51cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過3條線。,操作步驟,2.在孔中加入約5105個細胞，具體數量因細胞種類不同而不同，接種原則為過夜后融合率達到100%；3.用10mltip槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕，PBS洗滌2次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。,操作步驟,4放入375%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3h測量一次細胞運動的距離，拍照(具體時間依實驗需要而定)。,操作步驟,5.數據處理：每個時間點的距離長度-0時距離=每個時間長度細胞整體遷移的距離，求出均數和標準差，時間為橫軸，遷移距離為縱軸（單位mm）作圖，并比較初始0時與實驗結束時實驗組與對照組的照片。,注意事項,1.在用PBS緩沖液沖洗時，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細胞，影響實驗拍照結果。2.一般做劃痕實驗，都是無血清或者低血清（2%）否則細胞增殖就不能忽略。3.按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點，作為固定的檢測點，以解決了前后觀察時位置不固定的問題。4.實驗時應注意細胞生長狀況，選擇適當的細胞接種濃度。對不同的細胞要觀察細胞的貼壁率等，確定實驗時細胞的接種數量和培養(yǎng)時間，保證培養(yǎng)終止時密度適當。,實驗原理趨化運動是指細胞能夠感受到外界化學物質的濃度梯度，并沿著濃度梯度的方向所做的定向運動。趨化運動是一個非常保守的過程，對于生物體的生存、生命的繁衍等具有重要的意義。,趨化運動實驗（ChemotaxisAssay）,微孔小室中的趨化實驗,微孔小室中的趨化實驗是根據靶細胞（單核巨噬細胞，中性粒細胞或淋巴細胞等）能夠趨化性主動遷移，穿過一定孔徑的濾膜而設計的。濾膜（聚碳酸脂膜）將小室分隔成上下兩部分。靶細胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過濾膜形成梯度，細胞則沿著梯度穿過膜孔，黏附在膜的下面，計數濾膜下表面的細胞數即可測出趨化因子的趨化能力。,BoydenChamber裝置,實驗步驟,1.在冰盒內將趨化因子由高濃度向低濃度稀釋，將不同濃度的趨化因子置于趨化小室的下室，30ml/孔，每個濃度加3個孔，其中只加BM的孔為陰性對照；2.取對數生長期細胞，0.1%BM重懸細胞，調整細胞濃度為5105/ml；3.加樣：下室加不同濃度的趨化因子，將膜輕輕對折后展平，光面朝下毛面朝上，依次蓋上膠墊和上室將螺絲對稱擰上擰緊;在上室中加入細胞，50ml/孔，每個濃度加3個孔；,實驗步驟,4.將趨化小室在37，5%CO2的孵化箱中孵育3h；5.在膜的兩端加上夾子，毛面在PBS液面上蘸取，光面禁止碰到液體。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反復3次后再蘸取一次，晾干；6.固定,染色,實驗步驟,7.取載玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蠟，蓋玻片封片；8.顯微鏡觀察計數，每孔至少3個隨機視野，3個孔的數值取平均值;作柱狀圖，縱軸趨化指數或細胞數，橫軸組別；9.趨化指數(ChemotaxisIndex)=隨著趨化誘導因子的濃度梯度而遷移的細胞數目/用培養(yǎng)基做對照的遷移細胞數目,注意事項,1.膜，膠墊，上下小室之間防止有氣泡產生；2.放膜時要對準位置，過多調整位置，易發(fā)生交叉污染。3.槍垂直，槍尖伸入孔中下大概4/5處，迅速加樣，不要遲疑，打出液體的過程槍逐漸抬起，液體全部打出時槍尖離開液面。4.洗膜時注意，不要把細胞面與非細胞面弄反。,腫瘤細胞侵襲試驗,MatrigelInvassionAssay,Transwell系統(tǒng),Transwell小室,0.4um孔徑聚碳酯膜的掃描電鏡,原理,人工重構基底膜材料Matrigel，是一種細胞外基質，4時是液體，在37會逐漸凝固成膠狀。主要成分為層黏連蛋白和型膠原，能在培養(yǎng)基中重建形成膜結構，這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。,濾膜孔徑一般為8mm，而且膜孔都被Matrigel覆蓋，細胞不能自由穿過，必須分泌水解酶，并通過變形運動才能穿過這種鋪有Martrigel的濾膜，這與體內情況較為相似。,原理,Transwell電鏡圖片,實驗步驟及注意事項,1.無菌條件下Matrigel于冰浴融化，用PBS（或DMEMonly培養(yǎng)基）稀釋成1mg/ml濃度，-20C凍存?zhèn)溆茫?.取出已稀釋好的Matrigel，冰浴融化，以50ml的體積鋪于Tramwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好），37C放置lh，使Matrigel聚合成凝膠（注意：加基質膠時最好將24孔板放置在冰盒上，確保膠完全覆蓋孔底，不要有氣泡）；,3.每孔加入200ml1640（或DMEM）培養(yǎng)基使膠重構；4.在Transwell下室中加入趨化因子或10%FBS培養(yǎng)基600ml/孔；5.在上室孔中準確加入細胞l105個/孔，細胞懸液體積200ml，置于5%CO2培養(yǎng)箱于37C培養(yǎng)24h（注意：細胞量和時間根據實驗條件摸索）；6.待培養(yǎng)時間結束后，棄去上室液體，小心取出上室，用濕棉簽擦去膜上未穿過膜的細胞；,實驗步驟及注意事項,7.4%中性甲醛固定1