腎消通絡方對糖尿病腎病的防治作用及作用機制研究

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電鏡觀察電鏡液固定腎組織,。保存,沖洗次,鋨酸固定,去離子水沖洗脫水丙酮,丙酮,丙酮,丙酮,包埋,超薄切片,醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色。采用日立一型透射電子顯微鏡,倍率觀察、采集圖像。、表達的測定法免疫組織化學步驟腎組織經(jīng)多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋切片,制成厚度切片,切片脫蠟至水,浸沈,去離子水室溫孵育,沖洗維持,冷卻至室溫,枸櫞酸緩沖液沖洗,滴加封閉液,恒溫水浴箱孵育,吸去液體,滴加一抗,。過夜,沖洗。滴加生物素化二抗工作液,恒溫水浴箱孵育,沖洗,滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,恒溫水浴箱。孵育,沖洗,顯色,自來水沖洗,蘇木素復染,水洗,含的酒精溶液,自來水清洗,酒精,無水酒精,二甲苯,中性樹膠封片,待干。使用型顯微鏡和軟件采集圖像。研究論文免疫組織化學染色結果免疫組織化學染色陽性為棕黃色,陰性呈無色至淡黃色,細胞核藍色。的表達測定步驟總的提取,用勻漿器勻漿至透明狀,取腎皮質組織左右,加入轉移至另一離心管,室溫靜置離心,取上清液至另一離心管,加入氯仿,震蕩混勻,室溫靜置離一,取上層水相至另一離心管,加入異丙醇,充分混勻,室溫靜置離心,離心管的底部及側面可見在白色的小團沉淀,棄上清,加入酒精,棄上清,漂沈沉淀次。無菌工作臺中,沉淀干燥,加入雙蒸水處理,充分溶,稀釋,使用紫外分光光度計,讀取解。取和處值,/,即可使用,總濃度稀釋倍數(shù)肛/,用時調整為“肛。逆轉錄反應取總,肛,加入反應體系管中,反應體系,等。加入雙蒸水,處理至,震蕩混勻,離心,儀加入礦物油,合成,逆轉錄酶失活,。保存?zhèn)溆?。反應擴增引物退火溫度為一上游引物下游引物擴增片段為退火溫度為上游引物下游引物擴增片段為研究論文反應體系聚合酶,上樣染料,穩(wěn)定劑,優(yōu)化劑,反應體系反應緩沖液,逆轉錄反應產(chǎn)物,上下游引物等。震蕩混勻,短暫離心,儀加入少許礦物油,擴增。反應條件變性。,各自的退火溫度,個循環(huán)延伸。個循環(huán),一結果分析每個標本的擴增產(chǎn)物取肛,瓊脂糖凝膠含核酸染料電泳,以為標準片段標記,采用紫外透射儀觀察電泳結果,凝膠軟件分析目的電泳條帶,以電數(shù)碼相機照相,泳條帶為參照,待測條帶與進行對比,表示相對表達水平。/、的表達測定。步驟樣品處理取大約組織加提取液溶解于裂解液中勻漿提取,離心,取上清,分裝保存。配制不含二硫蘇糖醇的凝膠上樣緩沖液/、電泳液、溴酚藍、甘油,室溫保存,用時取/按比例加入緩沖液中。取樣品加上樣緩沖液混勻,一保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳準備清潔的玻璃板,用甘氨酸瓊脂糖將玻璃板下端封住。配制電泳分離膠。一甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠、丙、過硫酸烯酰胺、/、酰胺、,共。玻璃板間隙倒入分離膠,加水覆蓋頂層,聚合、丙烯酰后,吸干水,倒入成層膠、胺、/、過硫酸胺溶液、,共,插入梳子。待成層膠凝聚后,拔出梳子。加入樣本,加入電泳緩沖液,甘氨酸,。走成層膠,走分離膠。蒸餾水溶解,定容至,溶解研究論文膜轉移采用水浴式電印跡。配制水浴式電印跡用緩沖液,甘氨酸,蒸餾水溶解,定容至后,加甲醇,。冷卻。轉移按順序放置海綿、三層濾紙、轉移膜、膠、三層濾紙、海綿。轉移膜在正極,膠在負極,。免疫反應將膜置于封閉液牛血清白蛋白中靜止過夜。加入封閉液稀釋的第一抗體,室溫緩慢搖動,用洗膜次,每次振蕩后,加入封閉液稀釋的第二抗體,室溫緩慢搖動,。用沈膜次,每次振蕩顯色將膜浸入顯色液/加入二氨基聯(lián)苯胺,溶解后過濾,加入,室溫充分顯色后,立即用蒸餾水洗膜,將膜轉入中觀察、照相。結果分析照相分析,使用凝膠分析軟件,測定各條帶的平均光密度值值,待測蛋白質表達量與表達量比值,表示蛋白質的相對表達水平。統(tǒng)計學處理使用統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)資料分析。數(shù)值變量以均數(shù)加減標準差元虹表示。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,組間比較采用檢驗,所有假設檢驗方法顯著性水準以為準。結果。腎消通絡方對大鼠血糖的影響見對照組血糖處于正常范圍內,模型組、厄貝沙坦組、中藥組血糖水平較對照組明顯升高,中藥組血糖水平有下降趨勢,但較模型組、厄貝沙坦組之間無統(tǒng)計學意義胗。腎消通絡方對大鼠的影響見模型組、厄貝沙坦組、中藥組水平較對照組明顯升高,模型組較厄貝沙坦組、中藥組水平明顯升高,研究論文厄貝沙坦組、中藥組之間水平差異無統(tǒng)計學意義胗。、腎消通絡方對大鼠腎功能的影響見、模型組、厄貝沙坦組、中藥組、水平較對照組明顯升高尸,模型組較厄貝沙坦組、中藥組、水平明顯升高氏,厄貝沙坦組、中藥組之間、水平差異無統(tǒng)計學意義。、腎消通絡方對大鼠腎血脂的影響見、模型組、厄貝沙坦組、中藥組水平較對照組明顯升高,模型組較厄貝沙坦組、中藥組水平明顯升高,厄貝沙坦組、中藥組之間水平差異無統(tǒng)計學意義。各組之間水平差異無統(tǒng)計學意義,但中藥組水平有下降趨勢。腎組織病理形態(tài)學觀察見、染色對照組腎小球、腎小管形體結構基本正常模型組腎臟病理改變明顯,腎小球基底膜明顯增厚,細胞外基質積聚,系膜細胞增生厄貝沙坦組和中藥組較模型組病理改變減輕,兩組間差異不明顯。染色對照組腎小球形體結構基本正常,陽性物質無明顯增多模型組腎臟病理改變明顯,系膜區(qū)陽性物質增多,紅染明顯,腎小球基底膜明顯增厚,細胞外基質積聚厄貝沙坦組和中藥組病理改變較模型組減輕,陽性物質較模型組有所減少。電鏡觀察對照組腎小球基底膜結構基本正常,厚度均勻,足突結構正常,足細胞無調亡、脫落模型組腎小球基底膜廣泛增厚,部分節(jié)段明顯,大量足突融合和缺失,部分足細胞丟失厄貝沙坦組和中藥組病理改變較模型組減輕,腎小球基底膜增厚不明顯,足突融合較少。腎消通絡方對大鼠腎臟、表達的影響見、對照組、在腎小球,腎小管處均有少量表達模型組、厄貝沙坦組、中藥組、一的表達水平較對照組明顯升高,模型組在腎小球內可見、一大量表達,在內皮細胞、系膜細胞處均呈現(xiàn)表達增高,在細胞外基質也有散在陽性表達厄貝沙坦組和中藥組、。的表達水平較模型組有所降低,部分腎小球出現(xiàn)表達增高,整體水平較模型組呈現(xiàn)下調,厄貝沙坦組和中藥組之間差異不明顯。腎消通絡方對大鼠腎臟表達的影響見、研究論文】水平較對照組明顯升高模型組、厄貝沙坦組、中藥組一水平明顯升高,模型組較厄貝沙坦組、中藥組水平差異無統(tǒng)計學意,厄貝沙坦組、中藥組之間義。腎消通絡方對大鼠腎臟/、表達的、影響見、模型組/水平較對照組、厄貝沙坦組、中藥組明顯升高,對照組、厄貝沙坦組、中藥組之間/水平差異無統(tǒng)計學意義護。厄貝沙坦組、中藥組水平較對照組、模型組明顯升高尸,中藥組水平較厄貝沙坦組明顯升高,對照組、模型組之間水平差異無統(tǒng)計學意義。模型組、厄貝沙坦組、中藥組、水平較對照組明顯升高,模型組、中藥組、水平較厄貝沙坦組明顯升高尸,模型組、水平較中藥組明顯升高。研究論文附圖/。廠。弱巧加/廠研究論文/研究論文/研究論文衄、析一/研究論文研究論文。、譬囂鎣。研究論文蘧函組灞溺弱唆麟遴,。、父,惑、。磅。巴。二。,二籬簧七主曼挈,鬻冬每爻。母挈一棒。二。,一,一,二?；卓?一,蠢毋。乙阜蠕一、于警,、,、,。/,曦,。摹。,。氣每/、穸紫、,如,每臻一一一。奄,。氣一一。蕞茹一研究論文一“”叫礴囊蟄毫幽一一吣、一螄。一,二一一/,研究論文附表如婦尸婦研究論文氏姆氏元婦研究論文丈婦尸/婦如/欠研究論文虹火尸元如尸研究論文討論立題依據(jù)是的并發(fā)癥之一,屬微血管病變,是導致終末期腎病的主要原因,是患者致死、致殘的重要原因。我國的患病率呈明顯上升趨勢,的發(fā)生也在增加,患者高血壓、總膽固醇升高、白蛋白降低都是的危險因素【】。的臨床表現(xiàn)為蛋白尿,高血壓,水腫,漸進性腎功能損害,最后發(fā)展為。】早期的特點是腎小球濾過率增加、腎小球和腎小管肥大、腎臟增大,出現(xiàn)尿微量白蛋白增加,隨進展,蛋白尿增加,腎小球濾過率下降,腎小球和腎小管基底膜增厚,系膜細胞增生,細胞外基質增加,最后到達,出現(xiàn)腎小球硬化。如何有效的預防、治療,延緩的發(fā)展,保護腎功能,提高患者生存質量,是醫(yī)學界共同關注的問題。的發(fā)病機理尚未完全闡明,其發(fā)生和發(fā)展與多種因素相關。多種細胞因子參與的發(fā)生和發(fā)展,并且相互之間構成了復雜的網(wǎng)絡關系。是復雜細胞因子網(wǎng)絡中的核心因子,/信號通路在介導細胞外基質代謝異常,促進發(fā)病中起著重要的作用。、與一之間形成復雜的相互作用,共同參與的發(fā)病和發(fā)展。祖國傳統(tǒng)醫(yī)學】在的臨床治療中有著較好療效和特色優(yōu)勢,有減少蛋白尿、保護腎功能等作用,可延緩的進展,還可以改善和提高患者生存質量,的中西醫(yī)結合治療【效果較好,值得臨床推廣應用。川腎消通絡方”是在趙玉庸教授多年經(jīng)驗方“腎絡通”基礎【】上優(yōu)化而來,有著較好臨床療效,臨床證實腎消通絡方具有減少蛋白尿、改善腎功能、延緩腎臟進展等作用,為進一步探討其作用機制,進行了此項研究,期望為中醫(yī)防治提供實驗依據(jù)。動物模型的復制實驗性動物模型有多種類型,采用化學藥物誘導的模型較為廣泛。常用的有鏈脲佐菌素和四氧嘧啶。制備動物模型的成模率高,死亡率低,損傷較輕。的主要作用方式是可以選擇性的破壞胰島細胞,造成胰島素分泌低下,此外還可通過淋巴細胞介導的自身免疫作用使細胞不斷破壞。本實驗選擇采用大鼠研究論文腹腔注射方法,成功誘導模型。在實驗期間,造模動物血糖水平顯著升高,模型組動物出現(xiàn)尿微量白蛋白增高,腎功能下降,腎臟出現(xiàn)病理改變。的中醫(yī)理論認識祖國傳統(tǒng)醫(yī)學沒有的名稱,依據(jù)中醫(yī)理論辯證論治的思想,的臨床表現(xiàn),可以參考中醫(yī)消渴病相關文獻,可歸屬與消渴病相關的“水腫”、“腎消”、“尿濁”、“關格”等范疇,多數(shù)學者認為為“本虛標實”之證【】【,“本虛”以氣虛證、陰虛證為主,“標實常以痰濕、血瘀貫穿疾病的整個發(fā)展過程。隨著中醫(yī)絡病學的發(fā)展,的從絡論治【】己成趨勢,課題組基于趙玉庸教授“腎絡瘀阻”病機學說,形成了從絡論治的病機理論的發(fā)生是消渴病久病不愈,熱傷氣陰【,熱結、氣滯、痰濕、瘀血相互膠結,混處絡脈,腎絡瘀阻,在腎之絡脈形成“微型疲瘕”【,致。腎體受損,腎用失司,發(fā)生。方藥解析腎消通絡方是基于“熱傷氣陰,腎絡瘀阻”基本病機,以“益氣養(yǎng)陰,化瘀通絡”為治法組方而成。方中黃芪益氣健脾,利水消腫,元參下養(yǎng)腎陰兼清上焦之熱,黃連、地錦草清熱瀉火解毒,金雀根破血活血,丹參血活血,化瘀通絡,鬼箭羽軟堅散結,紅曲可藥食兩用,健脾化痰,活血化瘀,方中蟲類藥有多種,蟬蛻、地龍、烏梢蛇化瘀通絡。腎消通絡方對大鼠血生化和腎功能的作用腎消通絡方對大鼠血糖的影玎向時高血糖狀態(tài)是的重要始動因素。實驗期間對照組血糖穩(wěn)定在正常范圍內【,模型組,厄貝沙坦組,中藥組大鼠血糖水平持續(xù)保持在高位。實驗造模期間,動物死亡較多?？赡芘c短期血糖過高有關,實驗期間,動物死亡較少,死亡時間不規(guī)律。從結果看,中藥組血糖水平略有下降,但不明顯,可能是因為動物模型胰島細胞損傷過于嚴重,非降糖藥物難以恢復正常血糖。實驗研究發(fā)現(xiàn),降壓藥物【】【厄貝沙坦對具有保護作用,但其對血糖無顯著影響。本實驗結果同樣顯示,厄貝沙坦對血糖無顯著影響。腎消通絡方對大鼠的影響指尿中排出量超出正常上限,但尚未達臨床蛋白尿水平的中研究論文間階段。是誘發(fā)腎小球微血管病變最早期的客觀指標之一,對的早期診斷有重要意義。患者出現(xiàn)尿時,在病理組織學上可看到系膜的擴張或有少數(shù)結節(jié)性病變,在分期上屬于早期,及時進行治療和控制血糖水平,此期腎損傷是可逆的。實驗結果顯示,模型組大鼠的水平顯著升高,說明實驗模型的復制成功。與模型組相比,腎消通絡方可顯著降低大鼠的水平,厄貝沙坦同樣具有一定的作用。腎消通絡方對大鼠腎功能的影響、是臨床上判定腎功能常用的指標。實驗結果顯示模型組,厄貝沙坦組、中藥組大鼠、水平較對照組均有不同程度升高,對照組的腎功能正?！?說明發(fā)生和發(fā)展時對腎功能產(chǎn)生損害。腎消通絡方可明顯降低、水平,改善腎功能。腎消通絡方對大鼠血脂的影響、是常用的血脂指標,高糖高脂環(huán)境是發(fā)病的重要因素。本實驗選用普通飼料喂養(yǎng),實驗動物血脂略有變化。所有實驗動物水平未出現(xiàn)明顯升高,屬正常水平。模型組大鼠水平出現(xiàn)明顯升高,略超出正常水平厄貝沙坦組和中藥組水平較對照組略有升高,但仍屬正常范圍。實驗結果提示隨著時間延長,脂代謝出現(xiàn)紊亂,血脂有升高趨勢,腎消通絡方具有一定的降脂作用,改善血液環(huán)境。腎消通絡方對大鼠腎組織形態(tài)學的影響的病理改變主要是腎小球和腎小管肥大、腎臟增大,隨進展出現(xiàn)腎小球和腎小管基底膜增厚,系膜細胞增生,細胞外基質增加,最終導致腎臟纖維化,出現(xiàn)腎小球硬化。本實驗結果,染色對照組腎小球、腎小管形體結構基本正常模型組腎臟病理改變明顯,腎小球基底膜明顯增厚,細胞外基質積聚,系膜細胞增生厄貝沙坦組和中藥組較模型組病理改變減輕,兩組間差異不明顯。染色對照組腎小球形體結構基本正常,陽性物質無明顯增多模型組腎臟病理改變明顯,系膜區(qū)陽性物質增多,紅染明顯,腎小球基底膜明顯增厚,細胞外基質積聚厄貝沙坦組和中藥組病理改變較模型組減輕,陽性物質較模型組有所減少。電鏡觀察對照組。腎小球基底膜結構基本正常,厚度均勻,足突結構正常,足細胞無調亡、脫落模型組腎小球基底膜廣泛增厚,部分節(jié)段研究論文明顯,大量足突融合和缺失,部分足細胞丟失厄貝沙坦組和中藥組病理改變較模型組減輕,腎小球基底膜增厚不明顯,足突融合較少。實驗結果顯示腎消通絡能夠減輕腎臟病理損害,保護腎臟的基本形態(tài)結構。腎消通絡方對作用機制的分析腎消通絡方對及一的影響是發(fā)病過程中的重要細胞因子,是目前公認的致纖維化的細胞因子,在的發(fā)生和發(fā)展的起到重要作用。共有五種類型,在哺乳動物中只有、,在腎臟中主要表達。腎小球系膜細胞、內皮細胞、腎小管上皮細胞、間質成纖維細胞均能表達并合成。正常情況下,以無活性的前體形式存在。高血糖、,參與的整個病理過程,其是的重要致病介質【、機制之一是可使轉為有活性的成分,而且可以促進】能誘導系膜細胞及一的表達。者處于高糖狀態(tài)下,高糖表達,含量增高,導致細胞外基質過度積聚,同時,增加系膜細胞對葡萄糖的可誘導系膜細胞表達攝取,葡萄糖的攝取增加又促使表達,兩者之間形成惡性循環(huán),使病變過程大大加快。在介導細胞外基質代謝異常,促進發(fā)病中起著重要的作用。在生理情況下【】,細胞外基質的形成和降解維持在一個動態(tài)平衡的水平,發(fā)生和發(fā)展中多種因素導致細胞外基質的合成和降解失衡,最終導致腎小球硬化?？赏ㄟ^白分泌與旁分泌途徑,促進細胞外基質積聚,其作用途徑包括促進細胞外基質成分合成,如型膠原、促進蛋白酶抑制因子的表達,如纖溶酶原激活物抑制因子、金屬蛋白酶組織抑制因子,抑制組織細胞蛋白水解酶信使的表達等。在多種的模型中,如誘導的大鼠、自發(fā)性大鼠、自發(fā)性小鼠的腎臟,及表達均明顯升高,同時伴有腎臟肥大和細胞外基質增多?；颊叩氖滓委熓墙档脱撬?血糖水平對的發(fā)生和發(fā)展【有重要意義,降糖藥物【】可減少一在腎小球和腎小管的表達,減輕腎臟病理改變臨床顯示患者尿一水平與血壓控制有一定關系,降壓可使尿減少,這表明腎臟表達水平的下調,研究論文對的表達抑制是降壓藥物發(fā)揮防治作用的重要途徑。和患者的血液環(huán)境對腎臟有重要影響,高糖高脂可加速的發(fā)展,降低血脂水平同樣可對的表達產(chǎn)生抑制作用,他汀類藥物【可降低患者血清水平,在的治療中可以延緩其進展,改善腎功能。及表達明顯升高本實驗結果顯示模型組大鼠,其含量與腎臟病理損傷程度明顯相關,表明參與了的發(fā)生和進展。腎消通絡方可顯著降低及表達明顯升高,提示可能是腎消通絡方的重要作用靶點,進而減輕腎臟病理損傷程度,保護腎功能。腎消通絡方對/信號通路影響介導的信號轉導是多信號轉到,目前認為,/途徑是其主要的作用途徑。大多數(shù)細胞都存在受體【,主要有、型,、型受體胞質內有絲蘇氨酸激酶活性,是信號轉到通路必須的受體。家族蛋白是參與一在細胞內信號傳導的一族蛋白質。家族蛋白分為類受體激活型,包括、共同通路型,抑制型,包括、。參與一信號傳導的蛋白主要包括、。與受體結合后可使、磷酸化激活,激活后的、與形成復合物進入細胞核,作用于目標基因,完成對基因的調控可與一的型受體結合,但不能被活化,從而阻斷、的激活及后續(xù)作用。在正常生理條件下,/信號通路被負性調節(jié)嚴格控制,除可在受體段起抑制作用,核轉錄共抑制因子也參與負性調節(jié)機制,、剛、等可與/、/、/復合體結合,抑制信號激活基因轉錄。對/信號通路的負性調節(jié)減弱,可能是/信號通路在的作用機制之一。研究發(fā)現(xiàn)【,大鼠腎組織的表達顯著增加,的表達減少經(jīng)胰島素控制血糖后,的表達減少,顯著上調,大鼠腎纖維化病變明顯改善。研究顯示】在的發(fā)生和發(fā)展中,出現(xiàn)蛋白減少,使用抗抗體、反義寡核苷酸或基因敲除,可以預防或逆轉狀態(tài)小鼠腎臟纖維研究論文化。在中藥組方對的治療,/信號通路是重要作用機制之一。實驗【】【】表明中藥可通過影響/信號通路,下調、/,上調的表達,減輕的腎臟的病理改變。本實驗結果顯示模型組大鼠/表達水平明顯升高,表達水平較低,表明/信號通路是發(fā)生的關鍵機制。腎消通絡方可抑制及的表達,同時可降低/表達/信號通路的干預可能水平,提高表達水平,提示對是腎消通絡方