大腸桿菌表面展示體系磷酸鹽吸附能力的初步研究.doc

1、-范文最新推薦- 大腸桿菌表面展示體系磷酸鹽吸附能力的初步研究 摘要：微生物細(xì)胞表面工程是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的，它利用細(xì)胞表面展示技術(shù)使外源蛋白固定化于細(xì)胞表面，從而生產(chǎn)微生物細(xì)胞表面蛋白。微生物細(xì)胞表面工程可用于細(xì)胞催化劑、細(xì)胞吸附劑、活疫苗、生物傳感器的開(kāi)發(fā)等。微生物細(xì)胞表面工程具有廣闊的應(yīng)用前景，但是國(guó)內(nèi)對(duì)這一領(lǐng)域的研究尚剛起步。本課題以展示磷酸鹽吸附蛋白的大腸桿菌重組菌為研究對(duì)象，優(yōu)化其培養(yǎng)和測(cè)定條件，并測(cè)定其磷酸鹽吸附能力。結(jié)果顯示，與受體菌大腸桿菌JM109相比，重組菌具有明顯的磷酸鹽吸附能力。該結(jié)果為將重組菌進(jìn)一步應(yīng)用于除磷領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。6190關(guān)鍵詞：細(xì)胞表面展示；正磷酸鹽；吸附

2、；污水處理A preliminary study about the phosphate adsorption capacity of E. coli surface display systemAbstract：In recent years, microbial cell-surface engineering，which uses the microbial cell surface display technology to display foreign proteins on the microbial cell surface，was developed. Cell-surfac

3、e engineering can be used on cell-catalyst，cell-adsorbent，live vaccine，biosensor and so on，and have a wide application perspectiveHowever, in our country，the microbial cell-surface engineering is still a new research field. In our research, a recombinant Escherichia coli, which displayed phosphate b

4、inding protein (PBP) on the cell surface, was used to optimize the cultural and determination conditions. The phosphate binding ability of recombinant strain was further determined by the optimized conditions. The results indicated that recombinant strain showed high efficiency of phosphate binding

5、ability. These results demonstrated that PBP cell surface display system gained significant applications in phosphate removal.Key words: Cell surface display; orthophospha; adsorption; sewage treatment.目 錄1前言6 參考文獻(xiàn)261前言1.2 有機(jī)磷水解酶的大腸桿菌細(xì)胞表面展示PCR擴(kuò)增來(lái)自黃桿菌ATCC27551的有機(jī)磷水解酶基因opd ，直接用Xon I酶切與pZXL-T連接，將opd克隆于

6、錨定單元Lpp-OmpA編碼序列下游，轉(zhuǎn)化Ecoli BL21(DE3)經(jīng)抗性篩選、PCR鑒定和測(cè)序證實(shí)，成功構(gòu)建了具有全細(xì)胞催化效應(yīng)的大腸桿菌細(xì)胞表面展示工程菌SDS-PAGE結(jié)果表明，工程菌能表達(dá)產(chǎn)生51KDa的融合蛋白細(xì)胞表面展示的有機(jī)磷水解酶具有較高全細(xì)胞酶活性，用蛋白酶K消化處理重組菌表面蛋白可使其全細(xì)胞酶活降低907。全世界每年大約要消耗40萬(wàn)t的農(nóng)藥其中有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥占到總農(nóng)藥使用量的70%但真正被害蟲(chóng)吸收的量不到使用量的1 8。Richins等研究表明，表面展示OPH的工程菌講解對(duì)硫磷和對(duì)氧磷的速度是胞內(nèi)表達(dá)OPH工程菌株的7倍9，而且比純化的OPH更穩(wěn)定,活力更強(qiáng)10。通過(guò)物理

7、吸附將這種新型的生物催化劑吸附到固定載體上，代替固定化OPH，是一種用于殺蟲(chóng)劑脫毒的有效手段.然而在長(zhǎng)期的運(yùn)行過(guò)程中，微生物會(huì)逐漸的從載體上脫落，從而降低了固化細(xì)胞系統(tǒng)的有效性，利用可逆吸附或特殊吸附手段可以提高其穩(wěn)定性。近幾年，國(guó)內(nèi)的有機(jī)磷農(nóng)藥生物降解的研究發(fā)展迅速，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所范云六11 等，在有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶制劑基因工程研究方面也取得了重要進(jìn)展：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的顧立峰等以Pseudomona putida KT2440為宿主菌成功構(gòu)建高有機(jī)磷降解活性的基因工程菌。但是目前OPH表面顯示技術(shù)還存在一些問(wèn)題如利用表面顯示的OPH 活力相對(duì)較低且保持時(shí)間短，載體系統(tǒng)的表達(dá)效率不高

8、，表面顯示系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞自溶等現(xiàn)象，大部分研究尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段。此外，OPH水解有機(jī)磷化合物生成的對(duì)硝基酚(Pnitrophenol，PNP)仍是一種難降解化合物，已被美國(guó)EPA定為優(yōu)先污染物。因此，要實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷化合物的完全降解，還必須借助于分離和表達(dá)對(duì)硝基酚降解基因，這方面還有待科學(xué)家們的進(jìn)一步研究。 1.4.2吸附法除磷吸附法是利用多孔和大比表面積的固體物質(zhì)，通過(guò)磷在吸附劑表面的附著吸附、離子交換或表面沉淀來(lái)實(shí)現(xiàn)污水的除磷過(guò)程。這類(lèi)吸附劑需具有價(jià)格低廉，吸附效率高，性能穩(wěn)定，抗離子干擾性強(qiáng)，無(wú)有害物質(zhì)溶出，易再生等特點(diǎn)。天然吸附劑主要有粉煤灰、鋼渣、沸石、高嶺土、膨潤(rùn)土、活性氧

9、化鋁等，這些材料中含F(xiàn)e、Al、Ca和Mg等金屬元素氧化物，可作為陽(yáng)離子絮凝劑有效吸附磷20。天然材料易于得到，成本低廉且廢物利用，但吸附容量較低，產(chǎn)物不易處置。人工合成吸附劑的使用彌補(bǔ)了天然吸附劑的不足。目前已有Fe、A1、Mg、Ca、Ti、Zn多種金屬氧化物及其鹽類(lèi)作為吸附劑用于除磷技術(shù)的研究。該類(lèi)吸附劑較天然吸附劑吸附容量高得多，即使在較低的磷酸鹽濃度下依然具有強(qiáng)吸磷效果。人工合成吸附劑己成為吸附劑領(lǐng)域研究的主要方向。無(wú)論是化學(xué)除磷還是吸附除磷，磷的去除都是通過(guò)將污水中溶解性磷酸鹽轉(zhuǎn)化成不溶性固相狀態(tài)，通過(guò)固液分離從污水中將磷分離。但是這一固相形態(tài)可能為不溶的金屬鹽，這些方法回收得到的磷

10、無(wú)法循環(huán)持續(xù)利用，因?yàn)樗鼈兊幕厥湛赡芨綆е渌鼰o(wú)用副產(chǎn)品的回收，有些甚至是有毒的20。1.4.3人工濕地系統(tǒng)人工濕地21是低成本低能耗的環(huán)境污染控制體系，它是植物吸收、基質(zhì)吸附過(guò)濾和微生物轉(zhuǎn)化的綜合作用。人工濕地從多方面達(dá)到對(duì)污水的凈化作用，可分為表面流濕地、地下潛流濕地和垂直流濕地等類(lèi)型16,21。人工濕地是一個(gè)容器，其中生長(zhǎng)有水生或陸生植物等，這些植物尤其是大型水生植物淹沒(méi)或半淹沒(méi)的根系對(duì)污水有過(guò)濾作用。各種污水從一邊緩緩流入，水生植物過(guò)濾去除有機(jī)物，吸收氮、磷等植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，凈化后從另一邊流出22。此外，在淹沒(méi)的植物根系中附著生長(zhǎng)了大量的微生物，這些微生物能進(jìn)一步吸附和降解水中污染物，促

11、進(jìn)凈化效果。人工濕地具有良好的除磷效果。磷的去除是通過(guò)植物吸收，微生物吸附及基質(zhì)材料的過(guò)濾等綜合作用完成。磷是植物必須的營(yíng)養(yǎng)元素，污水中的磷被植物吸收而得到有效的循環(huán)利用。評(píng)估對(duì)浮萍的磷吸附能力發(fā)現(xiàn)，污水中磷含量下降了52以上21。蘆葦，莎草類(lèi)和茨藻屬植物磷吸附量高達(dá)90以上。此外，細(xì)菌也需要吸收污水中的磷，供自身生長(zhǎng)利用。磷在微生物細(xì)胞內(nèi)的累積可通過(guò)更換濕地中基質(zhì)材料而除去。濕地中的基質(zhì)材料通常含有較多的鐵、鈣和鋁氧化物等容易與磷酸鹽發(fā)生反應(yīng)生成難容磷酸鹽的物質(zhì)，從而降低污水中的磷含量16?？傊?，對(duì)各種污水中的含磷物質(zhì)，人工濕地均可有效去除。當(dāng)然，這要求針對(duì)污水來(lái)源的不同，選擇合適的植物，基

12、質(zhì)材料的大小和類(lèi)型，以及對(duì)濕地更好的設(shè)計(jì)。 1.4.5大腸桿菌磷酸鹽吸附蛋白1.4.5.1大腸桿菌磷運(yùn)輸系統(tǒng)磷是細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝不可或缺的重要元素。磷元素的獲得主要通過(guò)從環(huán)境中攝取磷酸鹽等含磷物質(zhì)，運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部達(dá)到為細(xì)菌細(xì)胞自身利用的目的。這一過(guò)程中涉及到磷酸鹽的吸收運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制以及表達(dá)的一系列相關(guān)蛋白。磷被大腸桿菌吸收以及在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸主要通過(guò)兩個(gè)系統(tǒng)即“PST系統(tǒng)”(Phosphatespecific transport system)和“PIT系統(tǒng)”(Phosphate inorganic transportsystem)完成

13、。PST系統(tǒng)是由一組典型的細(xì)胞周質(zhì)蛋白質(zhì)組成。一共4個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)參與了該系統(tǒng)的磷酸鹽運(yùn)輸過(guò)程，它們是phoS、pstA、pstC和pstB。phoS基因編碼的磷酸鹽結(jié)合蛋白是PST系統(tǒng)磷酸鹽吸收運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞周質(zhì)空間中結(jié)合磷酸鹽并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜。PST系統(tǒng)的轉(zhuǎn)膜部分由pstA和pstC兩基因編碼的包括6個(gè)跨膜a螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的疏水蛋白質(zhì)組成。pstB基因編碼的親水性蛋白質(zhì)包含ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該蛋白與PstA和或PstC蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜的胞質(zhì)一側(cè)結(jié)合。突變實(shí)驗(yàn)表明，在PstB提供的ATP能量作用下，PstA和PstC的a螺旋結(jié)構(gòu)域控制磷酸鹽通道的開(kāi)啟和閉合，磷酸鹽通過(guò)PstA和Ps

14、tC中間的3個(gè)精氨酸/谷氨酸(或天冬氨酸)鹽橋被轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)。PST系統(tǒng)的調(diào)控通過(guò)phoU基因編碼的調(diào)控蛋白完成(基因phoS、pstA、pstC、pstB和phoU共同組成的操縱子與其它一些磷饑餓誘導(dǎo)基因組成pho(phosphate)調(diào)節(jié)子。當(dāng)磷酸鹽充足時(shí)，phoS基因的表達(dá)處于低水平狀態(tài)。在環(huán)境中磷酸鹽有限時(shí)，phoR基因表達(dá)的整合膜蛋白傳感器通過(guò)磷酸化作用將phoB蛋白轉(zhuǎn)化成具有活性的形式，phoB蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上激活pho調(diào)節(jié)子中各個(gè)基因的表達(dá)。PST系統(tǒng)在磷酸鹽濃度高于lmM時(shí)受到抑制，但能抵抗解偶聯(lián)抑制劑。在PIT系統(tǒng)中，基因pit是主要基因。該系統(tǒng)允許細(xì)胞內(nèi)外磷酸鹽的交換，無(wú)需磷

15、酸鹽結(jié)合蛋白，受到解偶聯(lián)抑制劑的抑制。研究表明，兩種系統(tǒng)的磷吸附最大速率基本相同，但PST系統(tǒng)對(duì)磷的特異性和親和能力明顯高于PIT系統(tǒng)。 1.5本課題的研究目的和意義隨著微生物細(xì)胞表面工程近年來(lái)的發(fā)展，利用細(xì)胞表面展示技術(shù)可將外源蛋白展示于細(xì)胞表面，使外源蛋白充分與環(huán)境中底物分子接觸，生產(chǎn)一些供人類(lèi)生活實(shí)踐應(yīng)用的生物產(chǎn)品。本課題以展示磷酸鹽吸附蛋白的大腸桿菌重組菌為研究對(duì)象，優(yōu)化其培養(yǎng)和測(cè)定條件，測(cè)定其磷酸鹽吸附能力，為進(jìn)一步研究展示體系的展示效率和應(yīng)用領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。本課題有利于減輕生活中含磷水污染，對(duì)人類(lèi)的健康和對(duì)環(huán)境的維護(hù)都有極大的幫助。2 使用的材料試劑、儀器設(shè)備和采取的方法、技術(shù)2.1

16、 使用的材料試劑、儀器設(shè)備2.1.1 材料試劑質(zhì)粒：pTrcHis-C-inpN-gfp菌株：E. coli JM109.無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4• 7H2O 0.03 g，MnSO4• 4H2O 0.03 g，MgSO4• 7H2O 0.3 g，酵母膏0.4 g，蒸餾水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.5。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑磷酸二氫鉀貯備溶液：稱(chēng)取0.7165 g已于105 ºC干燥過(guò)的磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶于100 mL去離子水中并定容至1.0

17、L。此溶液1.0 mL含0.5 mg PO43-。磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液：含0.1 mg/mL PO43-；鉬酸鈉-硫酸溶液：1%(w/v)鉬酸鈉，10%(v/v) H2SO4。2.1.3儀器設(shè)備表2-1儀器設(shè)備圖儀器型號(hào)生產(chǎn)廠(chǎng)家溫度計(jì)（0-100）上海第三分析儀器廠(chǎng)試管1.5cm×15cm（×30）上海市第三分析儀器廠(chǎng)漏斗半徑4cm（×10）上海市第三分析儀器廠(chǎng)吸管0.20ml（×2）、0.50ml（×4）、1.0ml（×3）、2.0ml（×4）、5.0（×4）上海市第三分析儀器廠(chǎng)恒溫水浴鍋W201B

18、上海申勝生物科技有限公司 注：等JM109單菌落加入PCR小管后再加Taq酶擴(kuò)大：PCR反應(yīng)體系擴(kuò)大到50μL做2管（1管對(duì)照）圖2-3 50μL PCR反應(yīng)體系試劑名反應(yīng)組對(duì)照組10×PCR buffer5.0μL5.0μLphoS12.0μL2.0μLphoS22.0μL2.0μLMg2+3.0μL3.0μLdNTP2.0μL2.0μLTaq1.0μL1.0μL去離子水35μL35μLJM109單菌落加不加注：等JM109單菌落加入PCR小管后再加Taq酶PCR之后取5μL電泳（DL2000 Marker）。2.4磷酸鹽吸附試驗(yàn)2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作1）準(zhǔn)確吸取0，0.5，1，2，3，4 mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mL含0.1 mg PO43-)，分別加入到6支50 mL比色管中，用去離子水稀釋至10 mL；2）向各比色管中準(zhǔn)確加入4 mL鉬酸鈉-硫酸溶液及1 mL 0.15%硫酸肼溶液（w/v），混勻，放入沸水浴中煮沸10 min，取出，立即流水冷卻，用去離子水稀釋至刻度，混勻；3）以試劑空白