血液制品的質(zhì)量控制和安全性幻燈片課件

1、,血液制品的質(zhì)量控制及安全性,主要內(nèi)容,1、血液制品的概況 2、血液制品的分離純化技術(shù)和生產(chǎn)工藝 3、血液制品的安全性和病毒滅活 4、血液制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制,一、血液制品的概況,血液制品定義, 血液制品是指由健康人的血漿或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或由重組DNA技術(shù)制成的血漿蛋白組分，以及血液細(xì)胞有形成分。用于治療和被動免疫預(yù)防。 血液制品屬于治療用生物制品。,血液制品： 是高投入、高科技含量、高技術(shù)門檻、高風(fēng)險的生物產(chǎn)業(yè)。 是寶貴的人源性生物類藥品，對許多疾病有著不可替代的防治作用，關(guān)乎國計民生安全，屬于戰(zhàn)略性資源。 隨著國內(nèi)醫(yī)學(xué)進(jìn)步與實踐水平的提高，血液制品的臨床使用量和適應(yīng)癥

2、不斷擴大。,全球血制品銷售結(jié)構(gòu),白蛋白類制劑,主要作用； 1、維持血液滲透壓 2、抗休克作用 3、運輸和解毒作用 4、調(diào)節(jié)膠體滲透壓紊亂而引進(jìn)的機能障礙 5、營養(yǎng)供給,靜脈注射人免疫球蛋白的臨床應(yīng)用,1、特發(fā)性血小板減少性紫癜。 2、原發(fā)性免疫缺陷病的替代治療。 3、繼發(fā)性免疫缺陷病的替代治療。 4、川崎病。 5、艾滋病的輔助治療。 6、預(yù)防成人骨髓移植的感染和移植物抗宿主病。 7、其它免疫調(diào)節(jié)紊亂的適應(yīng)癥。,病毒檢測及滅活或去除技術(shù)進(jìn)展 提高制品純度的進(jìn)展 基因工程血液制品研究進(jìn)展 工藝技術(shù)的改進(jìn)： 高度自動化、智能化、擴大生產(chǎn)能力 病毒滅活和去除技術(shù)的提高綜合利用的研發(fā): 1-AT、 AT

3、-、纖原、冷沉淀、富含IgM/A-IgG 特免球蛋白的系列研發(fā)： 破免、乙免、靜注乙免、 綠膿桿菌特免、巨細(xì)胞病毒特免 、狂免、金葡特免、合胞病毒特,當(dāng)代血液制品的主要進(jìn)展,我國血液制品的發(fā)展趨勢,1、由血漿綜合利用低下階段向全面深度綜合利用方向邁進(jìn)。 2、由各自單一企業(yè)競爭轉(zhuǎn)向戰(zhàn)略重組或聯(lián)盟形式競爭。 3、硬件、軟件提高的同時，全面開展技術(shù)創(chuàng)新。 4、不斷開展臨床適應(yīng)癥的研究工作。,國內(nèi)血液制品發(fā)展, 1950年我國開始用鹽析法生產(chǎn)血液制品。 80年代末成都所是國內(nèi)第一家采用低溫乙醇分離技術(shù)的企業(yè)。 1996年蘭州生物制品研究所在國內(nèi)第一家成功引進(jìn)Octapharma血漿蛋白組分壓濾分離技術(shù)

4、。 1998年血液制品生產(chǎn)企業(yè)在全國率先通過GMP認(rèn)證。血液制品生產(chǎn)在GMP條件下進(jìn)行。 2001年人白蛋白在全國實行批簽發(fā)制度。揭開了生物制品批簽發(fā)的序幕?，F(xiàn)在血液制品全部實行批簽發(fā)，以保證每批制品安全有效。 2005年按特殊藥品管理.,國內(nèi)血液制品企業(yè)及規(guī)模, 30家血液制品生產(chǎn)企業(yè)，160家單采血漿站分布在19個省，設(shè)計產(chǎn)能12000噸，目前實際生產(chǎn)4000噸。 中國生物技術(shù)集團公司是國內(nèi)最大的血液制品生產(chǎn)企業(yè)，下屬天壇蓉生，上生，武生，蘭州四家企業(yè)。有國內(nèi)最先進(jìn)的生產(chǎn)車間，先進(jìn)的生產(chǎn)工藝，完整的全面質(zhì)量管理體系，先進(jìn)的質(zhì)量控制實驗室和強大的科研開發(fā)團隊，實現(xiàn)了血液制品生產(chǎn)過程的自動化、

5、管道化、在線檢測。,血液制品的相關(guān)法規(guī),血液制品安全與質(zhì)量控制體系 法規(guī)架構(gòu) 血液制品管理條例國務(wù)院令（1996年12月30日發(fā)布并開始施行） 藥品管理法 技術(shù)法規(guī) 技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 中國遏制艾滋病行動計劃（2006-2010）,技術(shù)體系,- 原料血漿控制 - 生產(chǎn)過程控制 - 病毒滅活/去除工藝,血液制品遵循的主要技術(shù)法規(guī),二、血液制品的分離純化技術(shù)和生產(chǎn)工藝,血液制品的分離純化技術(shù),大體上可以分為5類: 1、利用蛋白質(zhì)的親水性和疏水性即溶解度不同進(jìn)行分離的方法，包括：鹽析法、有機溶劑沉淀法、疏水層析法、凍融法、等電點沉淀法等。 2、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同，形狀和密度差異進(jìn)行分離的方法，包括：凝膠過

6、濾層析法、過濾和超過濾、離心和超離心、透析法等。,血液制品的分離純化技術(shù),3、利用蛋白質(zhì)帶電性的分離方法：離子交換層析法、制備電泳法等。 4、利用蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中的特定位點與配體的特異親和力進(jìn)行分離、純化的親和層析法。 5、其它方法：利凡諾，聚乙二醇，硫酸鋁鉀等。 應(yīng)多種方法組合 ，符合血漿綜合利用的原則。,蛋白質(zhì)在溶液中保持穩(wěn)定,根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同，即按蛋白質(zhì)親水性和疏水性的差異，進(jìn)行分離的方法（鹽析法、等電點沉淀法）。 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀和密度差異進(jìn)行分離的方法（凝膠過濾層析法、透析法、超濾法、離心和超離心法等）。 根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電性的不同進(jìn)行分離（離子交換層析法、制備電泳法等）

7、。 根據(jù)蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)中的特定位點與某種特定配體的特異親和力進(jìn)行分離（親和層析法）。,蛋白分離的基本原則 被分離和提純的蛋白質(zhì)應(yīng)盡可能保持天然蛋白質(zhì)的各種理化和生物學(xué)特性。如白蛋白多聚體含量的控制、IVIG的Fc活性的檢測等； 分離過程最大程度地避免或排除微生物及其代謝產(chǎn)物的污染。如熱原質(zhì)檢測、無菌檢查等； 工藝技術(shù)應(yīng)適應(yīng)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，分離步驟力求簡便、低消耗、高產(chǎn)出。如由Cohn氏法改良后的Kistler和Nitschmann法工藝，白蛋白的收率由20g/L增加到27g/L； 從血漿中可分離出多種蛋白質(zhì)成分，符合血漿綜合利用的原則。,血液制品的分離純化技術(shù),血漿蛋白的分離制備方法： 鹽析法

8、（硫酸銨鹽析法） 低溫乙醇法 離子交換層析法、親和層析法 利凡諾沉淀法（已淘汰） 聚乙二醇沉淀法,低溫乙醇法五變因素,蛋白濃度 乙醇濃度 溫度 pH 離子強度 五種參數(shù)加以組合，可形成許多種反應(yīng)條件,低溫乙醇法優(yōu)點,相對簡單的操作，產(chǎn)量高，適宜工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。 保持蛋白質(zhì)的天然特性。 抑菌作用。 同時分離多種血漿成分，適于血漿綜合利用。 乙醇作為主要原材料，價格低廉，易于獲得。,白蛋白生產(chǎn)工藝(1),混合血漿 FI+II+III上清 FIV上清 FV沉淀精制 超 濾配制巴氏消毒除菌過濾和分裝培育成品批簽發(fā)放行,白蛋白生產(chǎn)工藝(2),混合血漿 FI上清 FII+III上清 FIV上清 FV沉淀精

9、制 超 濾配制巴氏消毒除菌過濾和分裝培育成品批簽發(fā)放行,現(xiàn)行生產(chǎn)工藝,現(xiàn)行生產(chǎn)工藝： 低溫乙醇法（Cohn法 / Kistler- Nitcschmann法） - 低溫乙醇法：離心法 / 壓濾法 - 低溫乙醇法 / 層析技術(shù),柱層析法,離子交換層析、凝膠過濾和親和層析法。 離子交換層析法：采用不同的pH值和離子強度的緩沖液，使帶不同電荷的蛋白質(zhì)分離。PCC等凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白的制備。 交換劑如： DEAE-Sephadex A-50； DEAE-Sepharose CL-6B； CM-Sepharose CL-6B； Lysine-Sepharose 4B ； SP-Sephadex

10、 C-50； Q-Sepharose FF；,血漿蛋白分離純化的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù),血漿蛋白分離純化的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù),血漿蛋白分離純化的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù),無菌灌裝技術(shù),巴氏病毒滅活和低pH孵放病毒滅活技術(shù),三、血液制品的安全性和病毒滅活,血漿相關(guān)病毒的概念 原料血漿篩查及檢疫期管理 血液制品生產(chǎn)工藝去除病毒能力 血液制品病毒滅活/去除工藝 保證血液制品病毒安全性的其他措施,原料血漿的特殊性 具有潛在的病毒風(fēng)險，若獲得起始原材料的過程和生產(chǎn)過程控制不嚴(yán)密，可能導(dǎo)致血源性傳染病感染： 甲型肝炎病毒（HAV） 乙型肝炎病毒（HBV） 丙型肝炎病毒（HCV） 丁型肝炎病毒（HDV） 艾滋病病毒（HIV） 巨

11、細(xì)胞病毒（CMV） 人類細(xì)小病毒（HPV） 朊病毒（CJDV） 其他可通過血液傳播的病毒,單采血漿站及單采血漿,血液制品是以人血漿為原料生產(chǎn)的。 原料血漿來自單采血漿站采集的血漿。 單采血漿站由血液制品生產(chǎn)企業(yè)設(shè)置和管理，應(yīng)遵守血液制品管理條例、單采血漿站基本標(biāo)準(zhǔn)、單采血漿站管理辦法和單采血漿站質(zhì)量管理規(guī)范等法律法規(guī)的相關(guān)規(guī)定。,血漿運輸和貯存,血漿采集后，應(yīng)在6小時內(nèi)凍結(jié)，置 -20以下保存，保存期不超過3年。 血漿用專用冷藏車在-15 以下運輸。,檢驗,用國家中檢所檢定合格的批批檢試劑測定HBsAg、HIV抗體、HCV抗體、ALT、梅毒、血漿蛋白、抗-HBs等其他抗體含量。,原料血漿血清學(xué)

12、的檢測： HBsAg 抗HCV 抗HIV ALT 梅毒,原料血漿檢疫期, 2008年6月31日后建立原料血漿投料前的“檢疫期”制度. 血漿采集復(fù)檢合格后放置90天等獻(xiàn)漿員第二次獻(xiàn)漿檢測合格后投產(chǎn)。減少窗口期傳染。 若用NAT/PCR 檢測，“窗口期”可由90天縮短至60天.,三種病毒的窗口期平均天數(shù),ELISA NAT HCV 82 23 HIV 22 11 HBV 59 34,原料血漿采集管理流程（漿站）,* 檢測用試劑經(jīng)國家批批檢和入廠確認(rèn) * 采漿耗材經(jīng)入廠檢驗合格,原料血漿管理（血液制品生產(chǎn)廠家）,檢測試劑SFDA放行 檢測試劑使用前蓉生確認(rèn),保留樣品,血漿采集流程圖,冷鏈運輸,血液制

13、品的病毒安全性控制,Cohns低溫乙醇血漿組分法低溫乙醇沉淀法生產(chǎn)工藝中可去除一定量的病毒； 過濾法包括用于IVIG的深層過濾，經(jīng)確證能大量除去脂包膜和非包膜病毒，模型病毒為HBV、HIV、ParvovirusB19、HAV。,工藝技術(shù)去病毒能力,白蛋白三步沉淀病毒Log減少數(shù),工藝技術(shù)去病毒能力,IVIG三步沉淀病毒Log減少數(shù),工藝技術(shù)去病毒能力,血液制品的病毒滅活,血液制品安全控制 原料血漿安全控制 - 不同層次的病原體檢測方法 - 檢疫期制度：排除潛在危險的血漿 病毒滅活 / 去除工藝及其效果驗證 生產(chǎn)與質(zhì)量管理：cGMP 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制,現(xiàn)行原料血漿的安全控制方法,原料血漿： 單

14、采血漿站提供 排查：詢問病史、體檢、獻(xiàn)漿員管理系統(tǒng) 采漿站 / 血清學(xué)檢測（初篩）：HBsAg、HCV抗體、HIV-1/2抗體、梅毒和ALT 血液制品生產(chǎn)企業(yè)/ 血清學(xué)復(fù)檢：HBsAg、HCV抗體、HIV-1/2抗體、 梅毒和ALT 檢測試劑：國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)的、中國藥品生物制品檢定所逐批檢定合格的產(chǎn)品,原料血漿病毒安全控制體系,血源性疾病傳播的潛在危險/ 艾滋病等血源性疾病的控制 現(xiàn)行原料血漿病毒檢測方法的靈敏度限制 - 獻(xiàn)漿員管理：有效的身份識別系統(tǒng) 病原體篩選 ： 高靈敏度方法（NAT） 原料血漿“檢疫期”存放：排除病毒檢測的窗口期 - 原料血漿跟蹤系統(tǒng)：獻(xiàn)漿后追蹤,血漿的檢疫期制度

15、,血漿的檢疫期制度是對混漿投料前的原料血漿進(jìn)行固定時間放置和回顧檢驗的血漿處理方法。 - 使投料血漿的病毒污染程度降至最低 - 國外企業(yè)通常將原料血漿在混漿投料前冷凍放置90天 - 電腦化血漿跟蹤系統(tǒng)：跟蹤檢測結(jié)果,血液制品的病毒滅活 / 去除工藝,病毒滅活的必要性 病毒的窗口期 試劑靈敏度限制導(dǎo)致漏檢 人為差錯引起漏檢 已知經(jīng)血傳播尚未檢測的病毒：細(xì)小病毒B19、巨細(xì)胞病毒（CMV） 可能經(jīng)血傳播但尚未檢測的病毒,病毒滅活 / 去除工藝,國家藥監(jiān)局規(guī)定：血液制品生產(chǎn)工藝必須包括病毒滅活/去除步驟 血漿蛋白制品的生產(chǎn)：包括一步或兩步病毒滅活/去除工藝步驟 病毒滅活/去除方法： 須經(jīng)國家藥品管理

16、部門批準(zhǔn)后方可使用,經(jīng)血液傳播的病毒,HBV：雙鏈DNA ；脂包膜 ；40-45 nm HCV：單鏈RNA ；脂包膜 ；40-50 nm HIV：單鏈RNA；脂包膜；80-130nm HAV：單鏈RNA ；非脂包膜28-30nm 細(xì)小病毒B19：單鏈DNA；非脂包膜；18-26nm,病毒滅活方法：1、巴氏消毒法,巴氏消毒法（60/10h） 即在600.5連續(xù)加熱10-11小時。 白蛋白采用這個方法進(jìn)行病毒滅活，通常是在除菌過濾、分裝到最終容器以后進(jìn)行加熱處理。通常，為防止蛋白質(zhì)變性，在除菌過濾前要加入低濃度的辛酸鈉或辛酸鈉與N-乙酰色氨酸作為保護(hù)劑。 幾十年的臨床使用情況證明，采用低溫乙醇法和

17、巴氏滅活方法生產(chǎn)的白蛋白對肝炎病毒和HIV是安全的。,2、干熱法 (80/72h),凍干品加熱法 蛋白質(zhì)凍干除去水分以后可以耐受60-80或更高溫度。在80以上加熱可以產(chǎn)生令人滿意的對HBV、HCV、HIV和HAV的病毒滅活效果。 凍干品加熱法一般多用于凝血因子類產(chǎn)品。由于凍干后病毒也更穩(wěn)定，因此，必須進(jìn)行在規(guī)定條件下的病毒滅活驗證。 凍干品加熱法的病毒滅活效果受產(chǎn)品的水分殘留量、組成成分如蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸的含量以及冰凍與凍干時間的影響。 由于病毒滅活對水分殘留量特別敏感，因此要根據(jù)驗證結(jié)果設(shè)置允許的水分殘留限度，并保持瓶間殘留水分的差異處于限度內(nèi)。,3、S/D法,S/D法 TNBP(0

18、.3%)/Cholate(0.2%)（30/6h） TNBP(0.3%)/Tween-80(1%)（24/6h） TNBP(0.3%)/Triton-100(1%)（24/46h） 有機溶劑與去污劑的混合物（S/D）能夠破壞包膜病毒的脂膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致受到破壞的病毒無法與感染細(xì)胞結(jié)合。但該方法不能滅活非脂包膜病毒。,4、低pH法（pH：.000.20;24,21天）,低pH法 在某些酸性條件下, 脂包膜病毒可以被滅活。免疫球蛋白經(jīng)低pH如pH4）處理，可以有效滅活幾種脂包膜病毒。如在免疫球蛋白生產(chǎn)中，通常采用20-22，pH4.1培育21天。 滅活條件如pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度

19、、溶質(zhì)含量等因素，可能影響滅活效果，應(yīng)確定這些參數(shù)允許變化的幅度。,5、（亞甲基藍(lán)）法,M MB在白色熒光45000lux照射小時。 MB法已用于臨床血漿的病毒滅活,6、熒光法,補骨脂S-59(150M)結(jié)合UVA(3J/cm2),7、納米膜過濾法,使用20nm或50nm的膜過濾。 8、射線法,病毒去除方法,沉淀 層析（離子交換或親和層析） 納米膜過濾,血液制品常用病毒滅活方法,1.人血白蛋白：巴氏消毒法 （60 / 10小時） 2.IVIG / IMIG（包括特異性免疫球蛋白）： - 低pH孵放法 （pH4） - 巴氏消毒法 - 低pH孵放法加納米膜過濾 - 巴氏消毒法加低pH孵放法 - S

20、/D法 3. 人凝血因子: - S / D法 （有機溶劑 / 去污劑） - S/D法 / 100 、30分鐘， 干熱法：80 、72小時。,四、血液制品的質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制,質(zhì)量控制體系, - 國家批簽發(fā)管理 - 檢測實驗室認(rèn)證體系,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系,國家標(biāo)準(zhǔn) - 中國藥典 - SFDA標(biāo)準(zhǔn) 企業(yè)標(biāo)準(zhǔn) - 注冊標(biāo)準(zhǔn) - 申報標(biāo)準(zhǔn) - 內(nèi)部考核和放行標(biāo)準(zhǔn) 參考標(biāo)準(zhǔn) - WHO、 USP、BP、EP,安全性 有效性 穩(wěn)定性,血液制品生產(chǎn)的質(zhì)量控制,安全性 原材料的質(zhì)量控制 生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制 成品的質(zhì)量控制 外源性污染的控制,安全性 原材料的質(zhì)量控制 供應(yīng)商的質(zhì)量審核 原材料的質(zhì)量檢驗,安全性 生

21、產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制 生產(chǎn)工藝驗證 防止污染和交叉污染 防腐劑和穩(wěn)定劑 中間品保存和效期 血液制品生產(chǎn)中應(yīng)注意的問題,安全性 成品的質(zhì)量控制 成品外觀檢測 鑒別試驗 無菌試驗 熱原質(zhì)試驗 異常毒性試驗,外源性污染的控制 產(chǎn)品單支污染的控制 熱原的控制 Al3+含量的控制 不溶性微粒的控制,單支污染的控制 自動灌裝系統(tǒng) 嚴(yán)格的檢疫孵放過程 分裝車間良好的凈化控制,熱原的控制 鱟試驗的應(yīng)用生產(chǎn)過程，原液，成品 微生物限度控制 主要原材料 助濾劑，濾板的吸附作用 過濾分離的去熱原作用 全封閉的分離系統(tǒng)降低熱原二次污染的機會,Al3+含量的控制 鋁離子的來源： 原材料：助濾劑、濾板 內(nèi)包材：膠塞、瓶子 鋁離子的去除：超濾 2005年版中國藥典：人血白蛋白鋁離子200ug/L,不溶性微粒的控制 微粒污染的危害 注射液中常出現(xiàn)的微粒有：炭黑、碳酸鈣、橡膠屑、纖維素、玻璃屑、紙屑、細(xì)菌、真菌及芽孢、結(jié)晶等。 微粒污染的危害：異物微粒引起的病理現(xiàn)象： （1）肺肉芽腫和肺水腫； （2）靜脈炎； （3）過敏反應(yīng)； （4）局部組織栓塞與壞死 （5）腫瘤形成或腫瘤樣反應(yīng)。,不溶性微粒的控制 微粒污染的來源及控制 潔凈室內(nèi)的發(fā)塵量，90左右來自人員，為此，必須采取隔離人體污染的衛(wèi)生措施。 室內(nèi)微粒的其他污染源 空氣 室內(nèi)墻體、地面 設(shè)備、容器 物料 進(jìn)入潔凈室的物品