肝病的病理形態(tài)特點及免疫組化染色體會ppt課件.ppt

1、常見肝病的病理形態(tài)特點及免疫組化染色的幾點體會,復(fù)旦大學(xué)病理學(xué)系 張錦生,1,肝穿刺標(biāo)本檢查和處理原則,1. 肉眼觀察 肝穿刺標(biāo)本呈完整園柱狀，長度13 cm 典型的慢性肝炎肝纖維化標(biāo)本呈竹節(jié)狀外觀 肝硬化的穿刺標(biāo)本，呈不規(guī)則碎塊,2,2.石蠟切片 每張玻片上應(yīng)放置超過6個連續(xù)組織切片，有助于肝纖維化的病理診斷。,3,3. 染色 除常規(guī)染色供病理診斷用之外，根據(jù)條件 和需要作以下特殊染色： 網(wǎng)狀纖維染色， Masson三色染色， 膠原纖維染色(Sirius red或免疫組化 ),4, Dm-HSC -SMA-MFb,Dm,-SMA,5,S1,S2,S3,S4,各種病因引起肝纖維的病理學(xué)特點及分

2、期 1. 慢性肝炎肝纖維化 ( Dr.Scheuer 方案）,6,活動性纖維間隔靜止性纖維間隔,7,脂肪性肝病肝纖維化 穿刺肝組織呈淡黃色，標(biāo)本懸浮于固定液,小葉中央?yún)^(qū)纖維化竇周纖維化,8,3. 肝糖原累積病肝纖維,9,4. Wilson病,紅氨酸(Rubeanic acid)染色,銅被染成深綠色,10,5. 血色病 穿刺肝組織因含有大量含鐵血黃素沉著呈火焰紅色,肝細(xì)胞普魯氏藍(lán)染色陽性,11,6. 自身免疫性肝炎肝纖維化（AIH） 門管區(qū)肝細(xì)胞呈花環(huán)狀排列Hepatic Rosette ，表現(xiàn)為數(shù)個水樣變性的肝細(xì)胞被炎癥細(xì)胞和塌陷的網(wǎng)狀支架包繞成花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。,12,7. 原發(fā)性膽汁性肝硬化（P

3、BC） 3期（間隔期）90%出現(xiàn)自身抗體(A-Mit)，F(xiàn)lorid duct lesion+Biliary PN， 纖維間隔形成，肝細(xì)胞羽毛狀變性 4期（肝硬化） 靜止- 纖維間隔內(nèi)無炎癥或輕度炎癥 活動 Fibrous PN.,13,8. 血吸蟲性肝纖維化,14,肝癌(LIVER CANCER),HCC ICC Combined hepatocellular and cholangiocarcinoma,15,肝癌病理診斷常用免疫組化和特染,Hep Par1 線粒體相關(guān)抗原，與AFP無關(guān) 對胎兒和成人肝細(xì)胞高度特異 (HCC:陽性率82-97%）,16,AFP HCC陽性率：15-82%,

4、17,CD34: HCC型染色 長條分枝，管壁纖細(xì)，管腔狹窄，分布均勻彌漫.而非癌肝組織內(nèi)極少見.,18,CK 18: HCC,ICC, Metastatic carcinoma:100%+ 上皮性腫瘤標(biāo)志物,19,CK 19: 膽管型CK: CK19,CK7 肝細(xì)胞 膽管上皮，ICC：77-100% ICC最好的標(biāo)志物,20,CEA： monoclonal CEA:毛細(xì)膽管 ICC，轉(zhuǎn)移性肝癌：60-75%+ HCC:0-11%+ polyclonal CEA: 毛細(xì)膽管 HCC特異標(biāo)志物之一,21,CK 20: 胃腸道腺癌的主要標(biāo)志物 轉(zhuǎn)移性腺癌：74-100%+ ICC:10%+ HCC

5、:0%+,22,MOC31: 抗人上皮相關(guān)抗原 轉(zhuǎn)移性腺癌：100%+ ICC: 92.9%+ HCC: 0% + 胃癌肝轉(zhuǎn)移,23,HBsAg: HCC: 70-80% +,胞質(zhì)型，胞核型陽性,胞質(zhì)型，核周型陽性,24,黏液染色：AB/PAS 酸性黏多糖：蘭色（膽管腺瘤,ICC腔內(nèi)黏液） 中性黏多糖,糖原：紅色（假腺管型HCC),25,免疫組織化學(xué)染色的幾點體會,一、組織和細(xì)胞標(biāo)本制備 目的： (1)最大限度地保存組織結(jié)構(gòu)。 (2)最大限度地保存抗原性。 注意事項：在選擇組織處理方法前，先根據(jù)實驗?zāi)康?，參考抗體說明，確定組織處理方式(冰凍?石蠟?)。,26,1.取材,（1）原則：盡可能新鮮，

6、動物標(biāo)本可選 用動脈灌注固定。 （2）取材部位：盡量包括病灶和正常組 織交界處，避免選擇壞死組織。 （3）避免擠壓：受擠壓組織不但影響 HE切片的觀察，還造成非特異性 免疫組化組織著色。,27,2.固定,根據(jù)不同的染色目的，選擇不同的固定液，固定時組織越新鮮越好。組織塊厚薄大小要合適。 容器要大,固定液要寬余. 固定時間既要考慮充分固定,又不能太長(依組織塊厚薄大小從24hr至35天,太長可溶性抗原會滲漏,陽性會減弱甚至轉(zhuǎn)陰. 選擇最合適的固定劑,如用福爾馬林,必須用緩沖福爾馬林,28,3.制備蠟塊,沖水、脫水、透明、包埋。盡可能采用低溫石蠟包埋,如無低溫石蠟,可將組織塊盡可能修薄,以縮短脫水

7、、透明、包埋時間,盡可能保存組織內(nèi)抗原穩(wěn)定。,29,4.制備冰凍切片,冷凍包埋能較好保存抗原,新鮮及已固定材料均適合于冷凍包埋、切片。 防止冰結(jié)晶! 預(yù)處理:目的是減少組織中的水分以減少冰結(jié)晶的產(chǎn)生,方法是將已固定、沖洗的組織塊放入2030%蔗糖緩沖液內(nèi),4冰箱過夜,再將組織塊埋于OCT包埋劑 速凍:目的是使溫度很快下降迅速通過冰點,防止冰結(jié)晶產(chǎn)生。,30,速凍方法,液氮法:將OCT包埋的組織塊投入液氮數(shù)秒,等組織塊凍結(jié)后,立即移入低溫冰箱(裝入封口塑料袋內(nèi)密封)或放入恒冷切片機恒冷箱內(nèi)以備切片; 干冰-丙酮法:將200ml丙酮注入小型廣口保溫瓶或保溫杯內(nèi),逐漸加入干冰至飽和不再冒泡為止,溫度

8、可達(dá)-70;將裝有50ml異戊烷的小燒杯緩慢置入干冰-丙酮飽和液中;然后將OCT包埋的組織塊投入異戊烷內(nèi)速凍半分至一分鐘。,31,免疫組化染色后的襯染,常用蘇木精或甲基綠襯染細(xì)胞核。但如果陽性信號在細(xì)胞核,切勿襯染細(xì)胞核! 細(xì)胞質(zhì)襯染:1%亮綠,但退色較快,可改用堅固綠(FAST BLUE)染,則保存時間較長,32,封固和保存,絕大多數(shù)免疫酶染色后都可用樹膠封固，但如用DAB以外的底物應(yīng)注意有色沉淀物如為脂溶性，應(yīng)改用水溶性封固物如明膠、甘油緩沖液等。 酶免疫染色切片可保存數(shù)周甚至數(shù)月。 免疫熒光染色后應(yīng)盡快觀察、拍照。,33,一.常用免疫組織化學(xué)方法,免疫熒光: 用于培養(yǎng)細(xì)胞效果較好, 石蠟

9、切片因常有自發(fā)熒光,背景熒光較強,用時要注意 FITC(異硫氰酸熒光素) 用450490 nm光激發(fā),515nm 濾片觀察, 呈翠綠色 RB200(四乙基羅達(dá)明B200) 用570nm光激發(fā), 596 600nm濾片觀察,呈橘紅色 TRITC(四甲基異硫氰酸羅達(dá)明) 用530 560nm光激發(fā),580nm濾片觀察,呈紅色 Texas red 用595nm光激發(fā), 615nm濾片觀察,呈紅色 直接免疫熒光法: 間接免疫熒光法 雙重?zé)晒馊旧?34,2.免疫組織化學(xué),常用方法: PAP ABC或LSAB ELPS(二步法),35,20世紀(jì)70年（1970）Sternberg Peroxidase-a

10、nti-Peroxidase (PAP),36,20世紀(jì)80年代（1981） 許世民 ABC（親和免疫組化） Avidin-Biotin-Peroxidase Complex,37,90年代中期：Enhanced Polymer One Step (EPOS) EnVision (Enhanced Labelled Polymer System, ELPS)簡稱二步法 1 mol 含 70 mol HRP + 10 mol AB,38,如何做好免疫組化染色?,什么才是高質(zhì)量的免疫組化染色? 陽性信號突出 無背景染色 切片平整 無破裂/碎,無污穢,39,做好免疫組化染色幾點體會,1.組織細(xì)胞處理: 固定劑 固定時間 速凍防冰結(jié)晶 白片質(zhì)量好:平整,無破裂/碎,無污穢 防脫片 : 玻片絕對干凈 涂粘合劑: 白膠 多聚賴氨酸 鉻明礬明膠液 甲醛明膠液 貼片后冷風(fēng)吹干或37 /60烘干,40,2.抗體:特異性,高效價,親合力,適度稀釋度 3.石蠟切片- 抗原修復(fù) (1)蛋白酶消化: 胰蛋白酶 胰糜蛋白酶 鏈霉蛋白酶 蛋白酶K 胃蛋白酶 消化不足- 修復(fù)失敗,假陰性或信號弱 消化過度- 結(jié)構(gòu)破環(huán),脫片 (2)熱修復(fù): 微波照射 高壓加熱 水浴加熱 (3)微波+蛋白酶消化 注意點: 固定時間長,消化時間或熱修復(fù)時間適當(dāng)延長 酶生產(chǎn)廠家不一,或批號不一,消化時間可能也不一 熱修復(fù)的