總RNA的提取及RT-PCR.ppt

1、RT-PCR技術(shù),一、真核生物基因的表達(dá) 真核生物的基因含有大量的非編碼區(qū)，稱為內(nèi)含子（intron），真正編碼蛋白的區(qū)段是被內(nèi)含子隔開的，這些編碼區(qū)叫做外顯子（exon）。真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質(zhì)。,基因,mRNA,蛋白質(zhì)多肽鏈,真核生物基因的表達(dá),轉(zhuǎn)錄,翻譯,外顯子,內(nèi)含子,二、RT-PCR技術(shù)的應(yīng)用,RT-PCR是一種將cDNA合成與PCR技術(shù)結(jié)合分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法，主要用于： 檢測mRNA表達(dá)信息,進(jìn)行基因表達(dá)差異分析等研究 克隆cDNA 構(gòu)建cDNA文庫,實(shí)驗(yàn)一 Trizol法提取細(xì)

2、胞總RNA （一步法）,真核細(xì)胞總RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。 大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3端均有一多聚A(Poly A)尾巴。,真核細(xì)胞RNA的種類,RNA實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的RNA酶就會引起RNA的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以建立一個(gè)無RNA酶的環(huán)境對于制備RNA很重要。,實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備,常用的RNA酶抑制劑： 焦磷酸二乙酯

3、（DEPC）：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合，有高致癌性。（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段使用） 異硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同時(shí)也使RNA酶失活。 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。（合成cDNA階段使用）,1.在實(shí)驗(yàn)室最好有專門的RNA操作區(qū)，離心機(jī)、移液器、試劑等專用。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進(jìn)行除菌。 2.相關(guān)耗材(Ep管、Tip頭)應(yīng)先用0.1% DEPC水浸泡過夜并高壓消毒。也可直接使用廠家供應(yīng)的無RNase的Ep管、Tip頭。 3.金屬器械和玻璃器皿應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6hr或更長時(shí)間。,4.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或

4、用氯仿沖洗 5.配制的溶液應(yīng)盡可能加入DEPC至終濃度0.1%處理12hr以上，然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。（不能用DEPC或高壓滅菌的試劑，如Tris、DTT等，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過濾除菌） 6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中應(yīng)戴手套，避免講話。,7.一些組織如脾臟比其它組織含有更多的RNA酶；細(xì)菌比哺乳動物細(xì)胞含有更多的RNA酶。因此從這些樣本中制備RNA應(yīng)采取更嚴(yán)格的預(yù)防措施。,Trizol是一種苯酚與異硫氰酸胍(GTC)的混合物，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使

5、RNA進(jìn)入水相，離心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白質(zhì)保留在有機(jī)相中。轉(zhuǎn)移水相，加入異丙醇沉淀RNA，從而得到純化的總RNA。,實(shí)驗(yàn)原理,準(zhǔn)備試劑：Trizol, 氯仿，異丙醇，DEPC水，70乙醇(需用DEPC水配制) Trizol的用量： 組織 l ml50100mg ; 細(xì)胞 l ml10cm2培養(yǎng)瓶面積或106個(gè)細(xì)胞,操作步驟,取材:用生理鹽水漱口后，含生理鹽水約23min，用15ml離心管（4000rpm 5min）收集細(xì)胞(同管多次離心)，棄上清 沉淀中加入1ml TRIzol ，旋渦震蕩10 s 重懸沉淀，加樣槍打勻溶液后轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，1530放置5min 加入0

6、.2 ml氯仿，用手搖晃15 s，1530放置5min 12000rpm離心15min,小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml Ep管，加入等體積的異丙醇，1530放置10min 12000rpm離心15min，小心去上清，加入1ml 70%乙醇，震蕩數(shù)秒，8000rpm離心5min 小心去上清，室溫干燥5min，加入10ul DEPC水，打勻 55水浴10分鐘助溶,RNA保存： 溶解在無RNAase的水或TE中，在-70或更低溫度中保存時(shí)間在一年以內(nèi)，但避免反復(fù)凍融，應(yīng)分裝保存。 從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需溶解在去離子甲酰胺中存于-70，至少可以保存一年。需使用RN

7、A時(shí)，可以加入NaAc至終濃度0.3M，12000g離心5分鐘，70%乙醇洗滌后再用無RNAase的水或TE溶解。,RNA提取結(jié)果的鑒定： 紫外分光光度法測定260/280nm比值大約為2.0，如果比值過低，表明有蛋白質(zhì)或酚污染。 RNA濃度(g/ml)=OD260稀釋度40。,RNA電泳鑒定 通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否有降解 電泳檢測結(jié)果有三條清晰的rRNA 帶：28S，18S和5S （普通的1%瓊脂糖凝膠電泳也可用于鑒定，電泳槽用去污劑處理，水沖干凈，用新鮮的電泳緩沖液）,Total RNA,實(shí)驗(yàn)二RT-PCR,cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成： 第一鏈cDNA

8、的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用引物是oligo dT、隨機(jī)引物或基因特異引物（GSP）。 第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。,RNA 模板,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA-RNA 雜化雙鏈,RNaseH降解RNA,單鏈DNA,DNA聚合酶,cDNA,RT-PCR,Taq酶,oligo (dT)18,特異性下游引物,隨機(jī)引物,兩步法RT-PCR,cDNA第一鏈的合成,常用的反應(yīng)體系 10RT反應(yīng)緩沖液 2ul dNTP Mixture（各10mM） 2ul RNAase inhibitor (40U/ul) 0.5ul oligo

9、(dT)18 1ul 逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul 總RNA 0.51ug DEPCfree水 補(bǔ)足體系至20ul,操作步驟：,在發(fā)給每人一份的已制備分裝的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管里加入8ul 總RNA溶液,0.2ml Ep管，迷你離心機(jī)離心數(shù)秒，放置PCR儀中,42 30min（合成cDNA第一鏈） 85 5min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）,一步法RT-PCR,在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在同一管內(nèi)進(jìn)行。 優(yōu)勢：在處理大量樣品時(shí)易于操作；減少殘余污染；可以得到更高的靈敏度。 缺點(diǎn)：無法優(yōu)化反應(yīng)條件； 一旦失敗，必須重新提取總RNA,方案示例： 0.1-1ug 總RNA 200一5

10、00 umol/L的dNTP (每種) 0.5umolL 基因特異引物（上下游） 200 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶 1Taq聚合酶緩沖液 0.5-15mmolL MgCI2 1 mmo1L DTT 1.5U Taq聚臺酶 終體積為50ul。,半定量RT-PCR（semi-quantitative RT-PCR）,檢測特定基因的表達(dá)水平，檢測的手段 主要有Northern、半定量RT-PCR、熒光定量 PCR（realtime-PCR / Q-PCR）、基因芯片 等手段。,半定量RT-PCR是常用的一種簡捷、快速、 特異的RNA定量測定方法。通過mRNA 反轉(zhuǎn) 錄成cDNA ，再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 擴(kuò)

11、增產(chǎn)物以指 數(shù)形式增長, 通過測定PCR 產(chǎn)物的數(shù)量, 就可 以推測各樣品中特異mRNA的相對含量。 雖然此法只能測定mRNA 的相對含量, 但 在比較模型組和對照組樣品之間特異mRNA 的表達(dá)差異時(shí)足以說明問題.,1. 總RNA 的純度和完整性鑒定 總RNA 提取之后，用紫外分光光度計(jì)測定其純 度和濃度， OD260/ 280 應(yīng)在1. 8 2. 0 之間；然后 再用1% 瓊脂糖凝膠對總RNA進(jìn)行電泳，以鑒定其完 整性，濃度不高、完整性不好的標(biāo)本應(yīng)謹(jǐn)慎選用，以 免影響后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。,2. 內(nèi)參基因 半定量RT-PCR需選用體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)且在其它生理?xiàng)l件下不受影響或影響很小的管家基因片段作為內(nèi)

12、參。 半定量 RT-PCR多以-actin基因片段作內(nèi)參，-actin蛋白在各種細(xì)胞內(nèi)的含量都穩(wěn)定在10%左右。,另外常用的內(nèi)參照還有GAPDH, 它是一種細(xì)胞 內(nèi)代謝酶, 其基因?qū)儆诒Ｊ匦詮?qiáng)的“管家基因”, 該基 因在生物體內(nèi)普遍存在且穩(wěn)定表達(dá). -MG 、18S rRNA基因 也是常用的內(nèi)參。不 同的生物體其生命過程和生理過程各不相同, 選用何 種內(nèi)參要根據(jù)目的基因和實(shí)驗(yàn)的具體情況而定.,3. 引物設(shè)計(jì) 為了將擴(kuò)增的cDNA同痕量的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開，可以設(shè)計(jì)分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于痕量的基因組DNA的產(chǎn)物短。 設(shè)計(jì)擴(kuò)增內(nèi)參的引物應(yīng)使其退火溫

13、度與目的基因引物相差小于3，擴(kuò)增片段與目的基因擴(kuò)增片段相差200 bp 以上，便于觀測結(jié)果。,4. 同管擴(kuò)增 半定量 RT-PCR屬于內(nèi)標(biāo)式非競爭性PCR定量 技術(shù)，內(nèi)參需要與目的基因同管擴(kuò)增。 有時(shí)內(nèi)參基因表達(dá)水平相對目的基因太高，會抑 制目的基因的擴(kuò)增，可采用內(nèi)參引物后加的方式。,5. PCR 循環(huán)數(shù)的確定 PCR 反應(yīng)遵循酶促反應(yīng)定律，開始的循環(huán)內(nèi)擴(kuò) 增產(chǎn)物呈指數(shù)累積, 產(chǎn)物與模板呈線性關(guān)系, 半定量 RT-PCR 技術(shù)正是利用的這一線性關(guān)系, 通過擴(kuò)增產(chǎn) 物來對比總RNA中目的基因的表達(dá)。,RT-PCR應(yīng)在平臺期前結(jié)束,否則低水平表達(dá)的 mRNA 可能會增加到與高水平表達(dá)的mRNA 相

14、同的 拷貝數(shù), 因此, 為避免平臺效應(yīng)的影響, 合適的循環(huán)數(shù) 是PCR 半定量方法的關(guān)鍵因素之一。（一般為30以 內(nèi)） 通過預(yù)試驗(yàn), 在不同循環(huán)周期取樣電泳后灰度分 析, 以待測基因與內(nèi)參比值的對數(shù)分別與循環(huán)周期 作圖, 最后確定擴(kuò)增效率最大的循環(huán)數(shù), 這樣可有效地 避免因平臺效應(yīng)引起的誤差,6. 結(jié)果分析 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳圖譜經(jīng)凝膠分 析軟件進(jìn)行灰度分析，得到待測基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增 條帶的積分光密度值（IOD），計(jì)算各組樣品間 IOD待測基因/IOD內(nèi)參基因的比值，比值越大，說明該組樣 品表達(dá)豐度越高。,實(shí)驗(yàn)試劑： 2PCR Mix : Taq酶，四種dNTP， PCR反應(yīng)b

15、uffer 引物：上下游特異性引物 水（dd H2O）：用以補(bǔ)足體積 cDNA,實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng),建立PCR反應(yīng)體系 擴(kuò)增-actin基因 -actin引物 2 l cDNA 4 l 2PCR Mix 15 l 水 9 l total volume 30 l,此步注意事項(xiàng)： 1. 每次加樣要換Tip頭，以防試劑的互相污染 2. 避免重復(fù)加樣或漏加樣。 3. 加樣一定要準(zhǔn)確，正確使用微量移液器是關(guān)鍵。 4. 加完試劑后離心將液體匯集管底。 5. 對沒有熱蓋的PCR儀要加封石蠟油。,擴(kuò)增-actin基因程序的建立 預(yù)變性 945min 變性 9445s 復(fù)性 5945s 延伸 721min 續(xù)延

16、伸 7210min 保存 4,30 cycles,DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA,一、關(guān)于電泳與瓊脂糖凝膠電泳 電泳及其基本原理 常用的電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳的特性及其應(yīng)用（分離、鑒定和純化）,利用物質(zhì)的兩個(gè)差異來分離物質(zhì),電荷差異 電荷性質(zhì) 電荷數(shù)量,分子差異 分子大小 分子形狀,二、關(guān)于電泳與瓊脂糖凝膠電泳 電泳及其基本原理 常用的電泳方法 瓊脂糖凝膠電泳的特性及其應(yīng)用（分離、鑒定和純化）,三、DNA瓊脂糖凝膠電泳原理,在pH8.0（堿性）的環(huán)境中DNA的磷酸基團(tuán)解離，使DNA在該環(huán)境中帶上負(fù)電荷，在電場中向正極方向泳動，因?yàn)楦鞣NDNA分子的電荷數(shù)、構(gòu)象、分子量不同，它們在通過凝膠立體網(wǎng)絡(luò)是所受的動力和阻力不同，所以泳動的速度有差異，達(dá)到分離的目的。,實(shí)驗(yàn)材料及試劑 材料：-act