westernblot實驗方案.ppt

1、Western Blotting,匯報人：趙麗,Western blotting 中文名稱為免疫印跡，其程序是對經處理的樣本（血清、培養(yǎng)細胞和組織勻漿）先進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE),以分離蛋白。然后將電泳后的分離開的蛋白轉移至具有結合力的膜上。對印跡膜進行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。最后對膜上的蛋白質進行檢測。,Western blotting 實驗簡介,方法優(yōu)點,SDS-PAGE:高分辨力 固相免疫測定：高特異性、敏感性 1.方法簡便 2.標本可長期保存 3.結果便于比較,Western Blot基本原理,在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持

2、體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。,Western Blotting 方法,優(yōu)點： 1.快速（一種抗體） 2.沒有二抗交叉反應引起的非特異性條帶 缺點： 1.免疫反應性降低 2.無信號二級放大 3.抗體標記費時昂貴,使用不方便,一: 直接法,Western Blotting 方法,優(yōu)點： 1. 免疫特異性不受標記影響 2. 信號放大靈敏度高（多個二抗結合位點） 3. 多種標記的二抗可供選擇 4. 可選擇不同的Marker 缺點： 1. 交叉反應引起的非特異性條帶 2. 額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化,二、間接法,基 本 流 程,蛋白的提取,倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液 每瓶

3、細胞加3ml 4預冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕 搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。 按1ml裂解液加10 l PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。） 每瓶細胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動。 裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）,蛋白的提取,每瓶細胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解

4、20min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動。 裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行 于4下12000rpm離心5min。（提前開離心機預冷） 將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放于20保存。,配10分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用槍吸取，膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）

5、當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。,配4的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板),灌制分離膠 隔絕空氣,ddH2O 0.1%SDS:8%,灌制濃縮膠 插入梳子

6、,加 樣,加足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品 將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出),電 泳,采用恒壓得方法：1.恒壓80V，至樣本跑過 濃縮膠；2.將電壓調至120V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，準備進行進行轉膜。,轉膜,轉膜現(xiàn)有兩種方法： A. 半干轉：采用恒流的方法，按照1mA/ cm2計算總電流量，時間約為25-60min。（本法多使用NC膜） B. 濕轉法：采用恒流的方法，橫流150mA，1-2小時。（本法多使用PVDF膜，本法會產生大量的熱量，且對溫度敏感度較高，需用大量冰

7、塊降溫）,轉一張膜需準備6張濾紙和1張轉印膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。轉膜前，轉印膜以及濾紙均需浸潤在電轉液中活化15-20min（其中PVDF膜需在無水甲醇中活化30min后再浸潤于電轉液中，且濾紙應與膠和膜的大小一致）。 將玻板輕輕撬開，將凝膠剪裁后從玻板上移至電轉液中。從陰極到正極，按照三層濾紙 凝膠 轉印膜三層濾紙的順序制成“三明治”（如為濕轉，應在三明治的兩側各加一層活化過的海綿，同時應注意去除膜、凝膠和濾紙之間的氣泡，且兩側的濾紙不能相搭，避免短路引起轉膜不全）。,將制好的三明治放入電轉槽中，注意正負極的方向，凝膠側為負極，轉印膜側為正極。 轉完后將膜用1

8、麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白，將膜晾干備用。 將凝膠用考馬斯亮藍染色，觀察凝膠中的蛋白是否完全轉至印跡膜上。,此步可省略,標記,將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉3-4h。 將一抗用TBST稀釋至適當濃度（參照說明書）；室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。 同上方法準備二抗稀釋液，室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。 準備進行化學發(fā)光反應。,化學發(fā)光,加入化學發(fā)光劑后

9、，在化學發(fā)光儀下觀察結果，并用相關軟件分析結果。,發(fā)光液的配制:A、B液(各500uL)以1:1比例混勻。滴加發(fā)光液:用吸水紙將膜上殘余的洗滌液吸干,將膜放在保鮮膜上滴加配制好的發(fā)光液,觀察膜的變化,片刻后膜將變亮(若結果較好膜將會出現(xiàn)一條虛線,即為目的蛋白條帶)壓膠片(黑暗中進行):膜亮后,即刻壓片,防止淬滅現(xiàn)象的發(fā)生。(注意:準備工作做好:提前將暗盒、保鮮膜、膠片準備好)若光較亮壓片時間可短些,光較若壓片時間可適當延長(需摸索)。手動洗片(黑暗中進行):將片放在顯影液中洗20s左右,從顯影液中取出, 甩掉顯影液,(清水)放入定影液中大約20-30s,取出甩掉定影液。在光亮中觀察曝光情況。取

10、像分析:凝膠成像儀取像,分析光密度,計算結果。,SDS-PAGE電泳,膠不平？ 凝膠漏液？,膠板洗刷干凈 加入AP和TEMED的量要合適 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 溫度合適，受熱不均勻導致膠聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對齊,條帶比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”條帶？,凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調整鹽濃度 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適,SDS-PAGE電泳,轉膜及抗體檢測,凝膠腫脹或卷曲？ 條帶歪斜或漂移？ 單個或