westernblot實(shí)驗(yàn)方案.ppt

1、Western Blotting,匯報(bào)人：趙麗,Western blotting 中文名稱為免疫印跡，其程序是對經(jīng)處理的樣本（血清、培養(yǎng)細(xì)胞和組織勻漿）先進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE),以分離蛋白。然后將電泳后的分離開的蛋白轉(zhuǎn)移至具有結(jié)合力的膜上。對印跡膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。最后對膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。,Western blotting 實(shí)驗(yàn)簡介,方法優(yōu)點(diǎn),SDS-PAGE:高分辨力 固相免疫測定：高特異性、敏感性 1.方法簡便 2.標(biāo)本可長期保存 3.結(jié)果便于比較,Western Blot基本原理,在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持

2、體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。,Western Blotting 方法,優(yōu)點(diǎn)： 1.快速（一種抗體） 2.沒有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶 缺點(diǎn)： 1.免疫反應(yīng)性降低 2.無信號二級放大 3.抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴,使用不方便,一: 直接法,Western Blotting 方法,優(yōu)點(diǎn)： 1. 免疫特異性不受標(biāo)記影響 2. 信號放大靈敏度高（多個(gè)二抗結(jié)合位點(diǎn)） 3. 多種標(biāo)記的二抗可供選擇 4. 可選擇不同的Marker 缺點(diǎn)： 1. 交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶 2. 額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化,二、間接法,基 本 流 程,蛋白的提取,倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液 每瓶

3、細(xì)胞加3ml 4預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕 搖動1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。 按1ml裂解液加10 l PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。） 每瓶細(xì)胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。 裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）,蛋白的提取,每瓶細(xì)胞加400 l含PMSF的裂解液，于冰上裂解

4、20min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。 裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行 于4下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷） 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于20保存。,配10分離膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用槍吸取，膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會被沖變型。）

5、當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。,配4的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板),灌制分離膠 隔絕空氣,ddH2O 0.1%SDS:8%,灌制濃縮膠 插入梳子

6、,加 樣,加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品 將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出),電 泳,采用恒壓得方法：1.恒壓80V，至樣本跑過 濃縮膠；2.將電壓調(diào)至120V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，準(zhǔn)備進(jìn)行進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。,轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜現(xiàn)有兩種方法： A. 半干轉(zhuǎn)：采用恒流的方法，按照1mA/ cm2計(jì)算總電流量，時(shí)間約為25-60min。（本法多使用NC膜） B. 濕轉(zhuǎn)法：采用恒流的方法，橫流150mA，1-2小時(shí)。（本法多使用PVDF膜，本法會產(chǎn)生大量的熱量，且對溫度敏感度較高，需用大量冰

7、塊降溫）,轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張濾紙和1張轉(zhuǎn)印膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜廴灸?。轉(zhuǎn)膜前，轉(zhuǎn)印膜以及濾紙均需浸潤在電轉(zhuǎn)液中活化15-20min（其中PVDF膜需在無水甲醇中活化30min后再浸潤于電轉(zhuǎn)液中，且濾紙應(yīng)與膠和膜的大小一致）。 將玻板輕輕撬開，將凝膠剪裁后從玻板上移至電轉(zhuǎn)液中。從陰極到正極，按照三層濾紙 凝膠 轉(zhuǎn)印膜三層濾紙的順序制成“三明治”（如為濕轉(zhuǎn)，應(yīng)在三明治的兩側(cè)各加一層活化過的海綿，同時(shí)應(yīng)注意去除膜、凝膠和濾紙之間的氣泡，且兩側(cè)的濾紙不能相搭，避免短路引起轉(zhuǎn)膜不全）。,將制好的三明治放入電轉(zhuǎn)槽中，注意正負(fù)極的方向，凝膠側(cè)為負(fù)極，轉(zhuǎn)印膜側(cè)為正極。 轉(zhuǎn)完后將膜用1

8、麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白，將膜晾干備用。 將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察凝膠中的蛋白是否完全轉(zhuǎn)至印跡膜上。,此步可省略,標(biāo)記,將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉3-4h。 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（參照說明書）；室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液，室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。 準(zhǔn)備進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。,化學(xué)發(fā)光,加入化學(xué)發(fā)光劑后

9、，在化學(xué)發(fā)光儀下觀察結(jié)果，并用相關(guān)軟件分析結(jié)果。,發(fā)光液的配制:A、B液(各500uL)以1:1比例混勻。滴加發(fā)光液:用吸水紙將膜上殘余的洗滌液吸干,將膜放在保鮮膜上滴加配制好的發(fā)光液,觀察膜的變化,片刻后膜將變亮(若結(jié)果較好膜將會出現(xiàn)一條虛線,即為目的蛋白條帶)壓膠片(黑暗中進(jìn)行):膜亮后,即刻壓片,防止淬滅現(xiàn)象的發(fā)生。(注意:準(zhǔn)備工作做好:提前將暗盒、保鮮膜、膠片準(zhǔn)備好)若光較亮壓片時(shí)間可短些,光較若壓片時(shí)間可適當(dāng)延長(需摸索)。手動洗片(黑暗中進(jìn)行):將片放在顯影液中洗20s左右,從顯影液中取出, 甩掉顯影液,(清水)放入定影液中大約20-30s,取出甩掉定影液。在光亮中觀察曝光情況。取

10、像分析:凝膠成像儀取像,分析光密度,計(jì)算結(jié)果。,SDS-PAGE電泳,膠不平？ 凝膠漏液？,膠板洗刷干凈 加入AP和TEMED的量要合適 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對齊,條帶比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”條帶？,凝膠聚合不均勻，灌膠時(shí)候盡量混合均勻，動作輕緩 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時(shí)注意電泳槽裝置是否合適,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜及抗體檢測,凝膠腫脹或卷曲？ 條帶歪斜或漂移？ 單個(gè)或