DNA提取各種緩沖液的配制.doc

1、植物總DNA的提取一、所需儀器設(shè)備及消耗品剪刀、塑料袋（封口）、冰箱、棕色廣口瓶（1000、500、200、100、50ml）、量筒（1000、500、100、10ml）、燒杯（1000、500、200、100ml）、pH試紙、電子天平、高壓滅菌鍋、研缽、液氮罐（液氮）、水浴鍋、離心機(jī)、移液器（1套）、槍頭（1ml、200ml、20l）、槍頭盒、離心管（1.5ml）（包括盒和架）、一次性手套、電泳儀、電泳槽、塑料膠帶（寬）、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)、垃圾桶、冰盒（自制）、記號筆、單面刀片二、所需化學(xué)藥品及試劑CTAB、NaCl、EDTA-Na22H2O、Tris、冰乙酸、硼酸、-巰基乙醇、NaAc

2、、氯仿（三氯甲烷）、異戊醇、無水乙醇、溴酚藍(lán)、瓊脂糖、蔗糖、溴化乙錠（EB）、RNase、NaOH、HCl（濃）、ddH2O三、各種緩沖液的配制（一）2%CTAB提取緩沖液（300ml）（高壓滅菌）4mol/L的NaCl 35ml3=105ml1mol/L的Tris-HCl 10ml3=30ml0.5mol/L的EDTA 4ml3=12mlCTAB 2g3=6g（二）1TE（母液pH8.0）（50ml）（高壓滅菌）1mol/L的Tris-HCl（pH8.0） 500l0.5mol/L的EDTA（pH8.0） 100l最后加ddH2O定容到 50ml工作液為0.1TE（45ml滅菌的ddH2O中

3、，加入5ml已滅菌的1TE）（三）4mol/L的NaCl（150ml）（高壓滅菌） 35.055g的NaCl，加ddH2O120ml溶解，再加水定容到150ml（四）1mol/L的NaCl（400l）（用于配制RNase儲存液） 取4mol/L的NaCl（已滅菌）100l，加300l滅菌的ddH2O。（五）3mol/L的NaAc溶液（pH5.2）（50ml）（高壓滅菌）NaAc3H2O 20.405g加ddH2O 30ml用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至 5.2加ddH2O定容到 50ml（六）RNase儲存液（10mg/ml）（1ml）1mol/L的Tris-HCl（pH7.5） 10l1mol/L的Na

4、Cl 15lRNase 10mg沸水浴1520min（七）EB儲存液（1mg/ml）EB 30mgddH2O 30ml磁力攪拌至完全溶解，裝入棕色瓶，鋁箔包裹，保存于室溫。制膠時(shí)EB終濃度為0.5g/ml（30ml加15l、40ml加20l）（八）10TBE緩沖液（電泳緩沖液）（高壓滅菌）Tris堿 54g硼酸 27.5g0.5mol/L的EDTA（pH8.0） 20ml以上溶于400ml的ddH2O中，在定容到500ml工作液為1TBE或0.5TBE（九）6上樣緩沖液（4保存）0.25%的溴酚藍(lán)（2.5mg/1ml 40%（w/v）的蔗糖水溶液）40%（w/v）蔗糖水溶液（2g/5ml的dd

5、H2O，加熱溶解，注：溫度不能太高）（十）1mol/L的HCl溶液（不用滅菌） 8.62 ml的濃鹽酸，加滅菌ddH2O 91.38ml，混勻，室溫保存（100ml）。（十一）5mol/L的NaOH溶液（50ml，10g的NaOH溶于50ml滅菌的ddH2O中）（不用滅菌）200g的NaOH，溶于滅菌的ddH2O中，定容至1000ml（十二）1mol/L的Tris-HCl（pH8.0）（100ml）（高壓滅菌） 12.11g的Tris堿 80ml的ddH2O加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0（大約加4.2ml）（十三）0.5mol/L的EDTA（pH8.0）（50ml）（高壓滅菌） 9.305g的ED

6、TA-Na22H2O1g的NaOH 磁力攪拌器劇烈攪拌40ml的ddH2O最后加水定容到50ml，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0DNA定量用紫外分光光度計(jì)法，1 OD26050g/ml雙鏈DNA。PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）一、所需儀器設(shè)備及消耗品冰箱（4、20）、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、移液器（1套）、槍頭、槍頭盒、PCR管（包括盒和架）、PCR儀、離心管（包括盒和架）、一次性手套、電泳儀、電泳槽、塑料膠帶（寬）、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)、垃圾桶、冰盒（自制）、記號筆、單面刀片二、所需化學(xué)藥品及試劑質(zhì)粒（陽性對照）、引物（1、2）、4dNTP、DNA模板、buffer（MgCl2）、TaqDNA聚合酶、dd

7、H2O、瓊脂糖、DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品（DNA ladder）、溴化乙錠（EB）、5TBE電泳緩沖液（Tris、硼酸、EDTA）三、PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序僅供參考成分母液濃度各成分加入量（l/20l）各成分終濃度或含量無離子水9.7緩沖液（buffer）1021MgCl225mmol/L1.21.5 mmol/L4dNTP2mmol/L20.2 mmol/L引物5pmol/L20.5pmol/LTaqDNA聚合酶5U/l0.63U模板DNA20ng/l2.550ng操作順序： 水、4dNTP混合 buffer、taqDNA聚合酶混合，、混合 加入引物 混勻、分裝PCR管 向每個PCR管加入模板DNA

8、PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94預(yù)變性35min。進(jìn)入循環(huán)：94變性30s56退火3045s72延伸12min，3036個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后再72延伸7min。外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子DREB基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的誘導(dǎo)型表達(dá)與抗旱生理效果Induced Expression of DREB Transcriptional Factor and Study on Its Physiological Effects of Drought Tolerance in Transgenic Wheat成分母液濃度各成分加入量（l/25l）各成分終濃度或含量無離子水13？緩沖液（buffer）102.514dNTP2mmol/L20.2 mmol/L引物15？1mol/L？引物25？1mol/L？TaqDNA聚合酶5U/l0.2？1U模板DNA20ng/l1？50ngPCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94預(yù)變性5min。進(jìn)入循環(huán)：94變性45s45退火45s72延伸1min，35個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后再72延伸10min。一般PCR反應(yīng)中引物的終濃度為0.21.0mol/L，1.0mol/L時(shí)