分子生物學第六章-基因重組.ppt

1、Chapter 6,Genetic recombination,遺傳重組,重組recombination: 是已存在的遺傳物質產(chǎn)生新的組合的過程。 分子間或染色體間重組：離散的染色體混合時產(chǎn)生新的組合。如真核染色體減數(shù)分裂時的染色體獨立分配。不依賴酶。 分子內或染色體內重組：通過DNA的剪切和連接產(chǎn)生新的染色體類型。依賴酶。,分子內重組,同源重組homological recombination：同源性依賴，非序列專一性依賴。在大腸桿菌由RecA蛋白指導。 位點特異性重組site specific recombination：序列專一性依賴，非同源性依賴。由位點特異性重組酶指導。 轉座tran

2、sposition：非同源性依賴。由轉座酶、整合酶指導。酶識別轉座因子兩端特異序列，但受體位點相對非特異。 不正常重組或非常規(guī)重組illegitimate recombination：很少或不需要同源性。一般使用不正常底物進行細胞正常加工。與癌癥相關。 人工重組artificial recombination: 體外進行DNA的剪切和連接引起的重組，即基因重組。,一、同源重組,功能：減數(shù)分裂時染色體分配、DNA修復、特定噬菌體的復制、酵母的交配型轉換、真核基因組的遺傳作圖、基因導入 模型： 拷貝-選擇：在DNA復制中，新生鏈延伸時轉換為新的模板。如DNA修復。 斷裂-重新連接：重組沒有在復制中

3、產(chǎn)生，DNA鏈在雙鏈間斷裂、交換和重新連接。如減數(shù)分裂時染色體交換 雜合模型：包括上面兩種特征。,修復損傷DNA的同源重組,真核生物同源重組的斷裂與重接模型,Darlingtong D. C.于1936年提出：減數(shù)分裂同源染色體聯(lián)會時，非姊妹染色單體由于纏繞而產(chǎn)生張力，兩個染色單體在同一位置斷裂、重節(jié)，以消除張力，從而產(chǎn)生重組。 證據(jù)：姊妹染色單體的交換,Diploid eukaryotes: crossing over ( 雙倍體染色體交換),Homologous chromosomes line up in meiosis (when) The nonsister chromatids e

4、xchange equivalent sections (what),同源重組,發(fā)生在兩條DNA雙鏈之間 重組酶能以任何的同源序列為底物 重組的頻率在整組基因中并不很頻繁，但對整體和局部都有影響 重組的總頻率在精子和卵子中并不相同，在人類中女性是男性的兩倍 在整組基因內部，同源重組的頻率與染色體的構象有關，例如，十字結構將阻止附近的DNA重組變異。,染色體的重組包含部分的物理性的改變：破損與再聯(lián)合,細線期,偶線期,粗線期,雙線期,終變期,同化作用,在DNA雙鏈中制造一個破損,兩條DNA雙鏈分子的聯(lián)接作用是基因重組的關健環(huán)節(jié),同源染色體兩對DNA雙鏈在相應點產(chǎn)生nick，一條單鏈離開它的伙伴，與

5、另一個雙鏈分子的相應位置倒易位置，創(chuàng)造了兩個DNA雙鏈之間的連系，這種連接在一起的一對雙鏈叫做交差分子。 一個鏈與另一個鏈的連接點叫做重組關節(jié)。,重組關節(jié)能沿著DNA雙鏈分子移動，這種移動叫做枝狀遷移 在一條鏈被另一條鏈取代的過程中，分叉點可以沿任一個方向移動,交差分子旋轉后形成一個平面結構-Holliday結構,細菌基國重組中的單鏈同化作用 single-strand assimilation,DNA分子的單鏈部分通過堿基互補配對轉移到另一DNA雙鏈分子中，稱為單鏈吸收或單鏈同化。 有三個必備條件： 其中一個DNA分子必須有單鏈區(qū) 其中一個DNA分子必須有自由3端 單鏈區(qū)和3端必須設置在兩分

6、子互補區(qū)內,RecA催化單鏈的同化作用,RecA催化單、雙鏈DNA的反應分為三個階段： RecA在單鏈DNA上慢慢聚合。 單鏈DNA與其互補物在雙鏈上快速配對反應，產(chǎn)生異源雙鏈連接 單鏈從雙鏈中慢慢轉移，產(chǎn)生一個長的異源雙鏈DNA區(qū)帶。 SSB(單鏈結合蛋白)的存在刺激了這個反應,RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.,RecA catalyzes single-strand a

7、ssimilation,RecA介導的DNA修復,重組熱點,重組起始于雙鏈破損。雙鏈破損在軸素形成期產(chǎn)生，在聯(lián)會絲復合物形成階斷消失(60min) 在染色體上容易發(fā)生雙鏈破損的位點，稱為重組熱點。,Chi序列刺激它周圍附近的重組,與重組有關的基因稱為Rec基因 Rec突變體不能進行同源重組 大約1020個與重組有關的DNA位點通過E. coli 的Rec基因突變體鑒定 Chi序列能刺激它周圍附近的重組： 5GCTGGTGG 3 3CGACCACC 5 Chi序列在大腸桿菌中每510kb出現(xiàn)一次 Chi是一個被RecBCD基因編碼的酶的作用目標。,RecBCD是有強烈降解DNA能力的核酸酶，在S

8、SB存在下，有解開DNA雙鏈的酶活性和ATP酶活性，它在重組中所起的作用便是提供帶有自由3端的單鏈DNA。,Haploid prokaryotes (單倍體生物原核同源重組）,Between the two homologous DNA duplex (where),partially duplicated DNA of the chromosome between chromosomal DNA and “foreign” DNA,Nicks made near Chi (GCTGGTGG/each 4 kb) sites by a nuclease with recBCD. RecA bi

9、nds to ssDNA to form RecA-ssDNA.,How: Holliday model,3.RecA-ssDNA filaments search the opposite DNA duplex for corresponding sequence (invasion).,4.Seal the nicks and form a four-branched Holliday structure,5.Branch migration 2.轉座過程中出現(xiàn)共聯(lián)體； 3.轉座以后,可以造成原來轉座子位置的DNA缺失(非復制轉座)，也可以依然保持在原位，而在靶序列上復制了一個轉座子(復制

10、轉座); 4.轉座完成以后可以在靶序列上造成同向重復序列 5.轉座子插入后可影響所在位置的基因的表達,轉座子,轉座子指能將自身插入基因組中其它位置的一段DNA序列。插入位置與轉座子序列沒有相關性。 病毒、細菌和真核細胞的質?；蚧蚪M中都含有轉座子。 多數(shù)轉座子在插入新位點的過程中依賴其特異的插入序列去完成。 原核生物轉座因子包括：插入序列；轉座子；轉座噬菌體,IS element,基因組的進化既賴于獲得新的序列又賴于重排目前的序列。 轉座子可引起其它基因組順序的重排，提供基因組里變異的主要來源。重排可以產(chǎn)生新的序列和改變目前序列的作用。 細菌、噬菌體、病毒(尤其是逆轉錄病毒) 可以通過傳染傳遞

11、遺傳信息。,轉座子的特征性結構是它的末端具有反向重復序列，而兩側宿主DNA的鄰接末端是短的同向重復序列。 當考查DNA序列時，這種結構類型是判斷轉座子的鑒別特征，并且是這種序列起源于轉座作用的初步證據(jù)。,轉座因子IS,線型宿主DNA,插入后引起目標序列產(chǎn)生同向重復,Tn10 插入環(huán)狀DNA內,Tn10 再移動時可能從兩個方向移動，產(chǎn)生新的轉座子,Nonreplicative transposition describes the movement of a transposon that leaves a donor site (usually generating a double-stra

12、nd break) and moves to a new site.Replicative transposition describes the movement of a transposon by a mechanism in which first it is replicated, and then one copy is transferred to a new site.,復制轉座,非復制轉座,轉座產(chǎn)生的效應,Recombination between direct repeats excises the material between them,同向重復序列之間重組造成重復間

13、序列缺失,轉座產(chǎn)生的效應,Recombination between inverted repeats inverts the region between them.,反向重復序列之間重組造成重復間序列倒位,Transposition is initiated by nicking the transposon ends and target site and joining the nicked ends into a strand transfer complex.,轉座機制：在轉座酶作用下，在轉座子和目標序列的反式位點產(chǎn)生缺刻，轉座子通過末端聯(lián)會插入到目標序列中，形成共合體,Trans

14、position may fuse a donor and recipient replicon into a cointegrate共合體. Resolution releases two replicons復制子, each containing a copy of the transposon.,復制轉座：在共合體分解時轉座子產(chǎn)生兩個拷貝,缺刻,重組,復制,斷裂重接則造成非復制轉座Nonreplicative transposition proceeds by breakage and reunion,Each controlling element family has both au

15、tonomous and nonautonomous members. Autonomous elements are capable of transposition. Nonautonomous elements are deficient in transposition. Pairs of autonomous and nonautonomous elements can be classified in 4 families.,Controlling elements 控制因子in maize form families of transposons,可用于轉座子插入突變,自主轉座子

16、,非自主轉座子,The role of transposable elements in hybrid dysgenesis 雜種不育,帶有P因子,P品系的精子DNA釋放到卵細胞中時，精子基因組上的P因子被激活，發(fā)生轉座，引起突變,The retroviral life cycle proceeds by reverse transcribing the RNA genome into duplex DNA, which is inserted into the host genome, in order to be transcribed into RNA.,The retrovirus反轉

17、錄病毒life cycle involves transposition like events,LTR is an abbreviation for long-terminal repeat.,自然界中的其它基因轉移與重組現(xiàn)象,一、接合作用(conjugation) 二、轉化(transformation)和轉導(transduction) 三、轉染(transfection) 四、免疫分子的多樣性,接合作用：當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA就可以從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的方式。,一、接合作用(conjugation),轉化：通過自動獲取或人為地供給外源DN

18、A，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型。,二、轉化(transformation),轉導：當病毒從被感染的供體細胞釋放出來，再次感染另一受體細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用,轉導(transduction),三、轉染(transfection),轉染是轉化的一種特殊形式。 由transformation（轉化）和 infection（感染）兩詞構成。 原指將噬菌體、病毒或以其為載體構建的重組子導入受體細胞的過程。 通過感染方式將外來DNA引入宿主細胞，并導致宿主細胞遺傳性狀改變的過程稱為轉染。 將任何類型DNA轉移至動物細胞內的過程均可叫轉染。,思考題

19、,解釋:recombination; single-strand assimilation; 同源重組在生命活動和基因工程中的作用是什么? 同源重組的斷裂重接模型的基本內容是什么?(提示:考慮斷裂和重接的機制) 位點專一性重組有哪些主要特點?基因工程中是如何利用其原理進行基因克隆的? 轉座子的特征性結構是什么? 轉座可產(chǎn)生哪些的生物學或遺傳學效應? 自然界中存在哪些基因轉移與重組現(xiàn)象?（至少寫出5種以上） 試比較同源重組、位點專一性重組、轉座重組和人工重組間的異同點。,四、免疫分子的多樣性, 體液免疫反應 免疫球蛋白（Immunoglobulin）：高度特異性、龐大多樣性,L鏈（214aa）V

20、L、CL 和兩種，對一個Ig唯一 H鏈（426aa）VH、 CH1、CH2、CH3 恒定區(qū)的序列有 、和五種類型,VL和VH內有高變區(qū) 真正抗原結合部位 負責抗體分子對抗原的識別 互補決定區(qū)CDR,IgG、IgA、IgM、IgD和IgE （人體）,免疫球蛋白基因的組織, Ig基因有三個獨立的基因家族分別編碼兩個輕鏈（和）、 一個重鏈（小鼠 6、16和12號染色體）, 輕鏈基因家族的組成：L、V、J、C四類基因片段 Lleader segment V variable segment Jjioning segment Cconstant segment, 重鏈家族：L、V、D、J、C五類片段 D

21、diversity segment 高變區(qū), J和C之間有增強子, 種系中基因數(shù)目變動較大,人的重鏈基因簇包括了所有組織重鏈的基因信息（重鏈恒定區(qū)九種C片段、兩個假基因）,家族V基因后跟隨著幾個以J片段作為前導的C基因,k家族（人和老鼠）的組成： V 基因（人300、鼠1000 ）、5個 J（一個假基因）、 1個 C基因,免疫球蛋白基因形成過程中的重組機制, 除淋巴細胞外，所有細胞免疫球蛋白基因簇的結構都是 相同的種系結構, 骨髓干細胞在分化為成熟B淋巴細胞時出現(xiàn)免疫球蛋白 基因的體細胞重排, 即淋巴細胞中重組產(chǎn)生活性基因使免疫系統(tǒng)為基因組 的改變提供了廣泛的基礎 抗體分子的多樣性,1、輕鏈基

22、因V和J片段的重組,a） 鏈的重組, 每個C片段前有 J跟隨, 只發(fā)生一次重組 在V和J-C之間 (V和J的重組),b） 鏈的重組, 基因簇只有一個C, V與C之間 5個J （一個假基因）, 用到的每個 J都可以成為 V的外元終端,整合J右邊的J片段作為含子被剪切,整合J左邊的每個J片段都會缺失掉, 重鏈的可變 區(qū)由V和J基 因及第三個 D基因片段 編碼, 重鏈的可變 區(qū)重組有兩 個階段 D-J重組、 VH和DJ重組,2、重鏈基因V、D和J片段的重組, 一個指定的B淋巴細胞產(chǎn)生、其中之一輕鏈同重鏈結合, 輕鏈中表現(xiàn)為同型性項斥（isotypic exclusion） 往往只有鏈基因重組失敗，才發(fā)動鏈基因重組, 抗體中大部分輕鏈是 鏈，鏈往往占少部分 人類有約60%的輕鏈是鏈，約40%為鏈。老鼠有95% 的B細胞表達類型的輕鏈, 單特異性單個B細胞只產(chǎn)生一種抗體基因, 淋巴細胞為二倍體H、和都有兩個等位基因 重組表現(xiàn)為等位基因排斥（allelic exclusion）,3、重組的分子機制, 利根川進（Tonegawa S） 1987 Nobel prize,1） 重組位點, 輕重鏈重組涉及相同的機理（特異