分子生物學(xué)-08-1-第三章生物信息的傳遞-3轉(zhuǎn)錄后加工-小RNA-RNA拼接1

1、教學(xué)單元教案格式8 第3章 轉(zhuǎn)錄（之轉(zhuǎn)錄后加工-小RNA-RNA拼接1） 課程教案授課題目：第3章 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄后加工-小RNA-RNA拼接1 第四周 第二次課教學(xué)時(shí)數(shù)：2授課類型： 理論課 實(shí)踐課教學(xué)目的、要求：理解：真核生物mRNA前體的加工了解：細(xì)胞內(nèi)的RNA組分小RNA的功能研究進(jìn)展 教學(xué)重點(diǎn)：重點(diǎn)闡明：內(nèi)含子的剪接重點(diǎn)指出：原核生物RNA與真核生物RNA加工的本質(zhì)區(qū)別教學(xué)難點(diǎn)：絕對(duì)難點(diǎn)：內(nèi)含子的剪接方式相對(duì)難點(diǎn)：無教學(xué)方法和手段：老師講授為主：講授 視頻演示 PPT演示 討論。以電腦幻燈片邊演示邊講述為主，（白板課件）輔以板書（黑板板書）學(xué)生回答問題為輔：（如時(shí)間等條件許可的情況下）注

2、：以下內(nèi)容按實(shí)際需要進(jìn)行取舍 要求有多媒體，因?yàn)樾畔⒘看?，許多結(jié)構(gòu)圖需要媒體放映，效果才好教學(xué)內(nèi)容與教學(xué)設(shè)計(jì)：由于本課涉及到大量乃含子的剪接方式，而這些東西又是比較新的，同時(shí)是各個(gè)大學(xué)考研的熱點(diǎn)，所以本課增加一些這方面的最新進(jìn)展，并不完全按照教材的安排進(jìn)行。 另外更重要的是，在細(xì)胞表達(dá)的RNA中除了我們熟悉的3類RNA之外，還有大量的不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA，即在細(xì)胞表達(dá)的RNA中，除了我們所熟悉的3類RNA外， 還有大量的不編碼蛋白質(zhì)的非編碼RNA分子(noncoding RNA，ncRNA)，調(diào)控真核細(xì)胞中的許多功能，影響基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控和個(gè)體發(fā)育等多種行為，這使科學(xué)家對(duì)細(xì)胞及其進(jìn)

3、化的看法進(jìn)行重新反思。小RNA是2l一28 nt的調(diào)控RNA分子，主要包括微RNA(micro RNA，miRNA)和小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)兩類，其中的miRNA成為繼siRNA之后新的研究熱點(diǎn)之一，名列2002年和2003年美國(guó)科學(xué)雜志評(píng)出的年度十大科學(xué)成就。miRNA是microRNA(微RNA)的簡(jiǎn)稱，它是小的調(diào)節(jié)植物和動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育的RNAs，是由非蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄物形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)加工而來的長(zhǎng)度在22 nt左右的小RNA分子，影響目標(biāo)mRNAs的翻譯和穩(wěn)定性。miRNAs在真核生物內(nèi)作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)子起作用。已知植物miRNAs能在轉(zhuǎn)

4、錄后水平上抑制基因表達(dá)，主要靠引導(dǎo)mRNA裂解和抑制目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的翻譯。此外，發(fā)現(xiàn)植物miRNAs也能決定目標(biāo)染色體位點(diǎn)的甲基化，在轉(zhuǎn)錄水平上起作用真核細(xì)胞中存在數(shù)目龐大的miRNAs可能是基因調(diào)控途徑中豐富而重要的組分，發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。miRNAs的發(fā)現(xiàn)是生命科學(xué)的一大突破，它拓展和豐富了以往人們對(duì)小分子RNA 的認(rèn)識(shí)，促使生物學(xué)家重新反思對(duì)細(xì)胞進(jìn)化的理解和認(rèn)知。miRNA與RNA沉默有關(guān)，理解RNA沉默機(jī)制可闡明人類疾病。成熟的生化方法和對(duì)RNA沉默的作用及機(jī)制的其它剖析方法的發(fā)展，將對(duì)RNA沉默機(jī)制提供更多的視點(diǎn)。真核生物轉(zhuǎn)錄后存在復(fù)雜的加工RNA的加工的類型l 剪切及剪接：剪切就是剪去部

5、分序列；剪接是指剪切后又將某些片段連接起來。l 末端添加核苷酸：加帽、加尾， tRNA的3-末端添加-CCA。l 修飾：在堿基及核糖分子進(jìn)行化學(xué)修飾。l RNA編輯：某些RNA，特別是mRNA自DNA模板上所獲得的遺傳信息，在轉(zhuǎn)錄作用后又發(fā)生了變化。 5 mRNA轉(zhuǎn)錄后加工主要包括：原核生物轉(zhuǎn)錄生成的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本mRNA不需經(jīng)過復(fù)雜的加工就表現(xiàn)有活性。唯一的加工作用是多順反子mRNA在RNase的催化下，裂解為單獨(dú)的順反子。 真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA要經(jīng)過較復(fù)雜的加工過程。包括：5末端加帽 3端加尾剪接去除內(nèi)含子并連接外顯子 RNA編輯 甲基化修飾。5.1 5端加帽加帽(adding cap)

6、：即在mRNA的5-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，即hnRNA即可進(jìn)行加帽。加工過程：首先是在磷酸酶的作用下，將5-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)構(gòu)，再對(duì)G進(jìn)行甲基化。 帽子結(jié)構(gòu)功能：1.能被核糖體小亞基識(shí)別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合； 2.m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA 5末端，以保護(hù)mRNA免受5核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。3在某些細(xì)胞中能夠引發(fā)病毒RNA（）鏈的復(fù)制5.2 3端加尾在3端加上一連串的A，即poly A尾巴，這是由RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶催化的，其功能表現(xiàn)在：與mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)中有關(guān)，以及起到一種穩(wěn)定mRNA

7、的作用。加尾過程：內(nèi)切酶在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前面的終止信號(hào)，一般是AAUAAA后面的1030個(gè)堿基處切斷RNA前體，然后在腺苷酸聚合酶的作用下加上一連串的A。5.3 5端的甲基化修飾在 5端的第1或1和2位的堿基上有時(shí)候會(huì)發(fā)生甲基化，起穩(wěn)定作用。真核生物轉(zhuǎn)錄后加工除了上述加帽、加尾、甲基化之外，還表現(xiàn)在RNA剪接和RNA編輯兩個(gè)方面（單獨(dú)講解）6 tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工概述：真核生物的tRNA基因的數(shù)目比原核生物tRNA基因的數(shù)目大得多。例如大腸桿菌基因組約含有60個(gè)tRNA基因，果蠅850個(gè)，而人體細(xì)胞則有1300個(gè)。真核生物的tRNA基因也成簇排列，并且被間隔區(qū)分開。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為4.5S或稍大的tRN

8、A前體，相當(dāng)于 100個(gè)左右的核苷酸。成熟的分子為4S，約含70-80個(gè)核苷酸。前體分子的5端和3端都有附加序列，需由核酸內(nèi)切酶和外切酶加以切除。真核生物的tRNA前體的3端不含CCA序列，成熟分子中的是后來加上去的。在分子中還具有2-O-甲基核糖，含量約為核苷酸的百分之一。具有居間序列的前體還必須將這部分切除。加工內(nèi)容1. 在核酸內(nèi)切酶 RNaseP作用下，從5末端切除多余的核苷酸發(fā)夾結(jié)構(gòu)。2. 在核酸外切酶 RNaseD作用下，從3末端切除多余的核苷酸發(fā)夾結(jié)構(gòu)。3. 核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化， 3末端加CCA-OH，為tRNA加I特有反應(yīng)。4. 核酸內(nèi)切酶催化進(jìn)行剪切反應(yīng)，剪掉內(nèi)含子，由連接酶連接

9、外顯子部分。5. 化學(xué)修飾作用，如甲基化、脫氨基、還原反應(yīng)。tRNA的轉(zhuǎn)錄后處理需要多種酶系，其中1、能夠識(shí)別發(fā)夾結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶；2、RNAase D 3、RNAase P 4、增加特殊堿基 的酶，比如增加硫尿嘧啶、假尿嘧啶等6 rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工特征：1、原核生物和真核生物是較為相似的，分別由多種rRNA組成它的核糖體，包括5S rRNA 、5.8S S rRNA、 18 S rRNA、 28 S rRNA 2、不同沉降系數(shù)的RNA是在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元中一起轉(zhuǎn)錄的RNAaseIII酶系處理3、前體先在特定堿基處甲基化，然后斷裂再經(jīng)過核酸酶的作用除去一些核苷酸殘基，4、有內(nèi)含子的進(jìn)行內(nèi)含子剪接（

10、下面專門講解）7 內(nèi)含子剪接7.1 三個(gè)概念真核生物中基因的編碼序列是不連貫的，即在兩個(gè)編碼序列之間有段不編碼蛋白質(zhì)的非編碼序列，稱為斷裂基因（interrupted gene 或者split gene）編碼序列稱為外顯子(exon)，非編碼序列稱為內(nèi)含子(intron)。這是最初的定義，后來人們定義為：外顯子是出現(xiàn)在mRNA中的基因序列，內(nèi)含子是不出現(xiàn)在mRNA中的序列少數(shù)細(xì)菌基因中也發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子的序列7.2 內(nèi)含子的類型內(nèi)含子有8種類型，其中一種是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，其余7中是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的。1、GU-AG內(nèi)含子，屬于真核細(xì)胞核mRNA前體內(nèi)含子；2、AU-AC內(nèi)含子，屬于真核細(xì)胞核mRN

11、A前體內(nèi)含子；3、Group I內(nèi)含子，真核細(xì)胞核rRNA前體，細(xì)胞器RNA，少數(shù)細(xì)菌RNA；4、Group II內(nèi)含子，細(xì)胞器RNA，細(xì)菌RNA；5、Group III內(nèi)含子，細(xì)胞器RNA；6、孿生內(nèi)含子（雙內(nèi)含子），細(xì)胞器RNA；7、tRNA前體內(nèi)含子，真核細(xì)胞核tRNA前體；8、古細(xì)菌內(nèi)含子，各種RNA。以上這種分類方式分得太細(xì)了，實(shí)際上從內(nèi)含子剪切的方式大致可以分為兩類，一類能夠自我剪切的，另一類是不能夠自我剪切的。Group I、II、III類內(nèi)含子都能夠自我實(shí)現(xiàn)剪切，其它類則不行。7.3 RNA剪接化學(xué)反應(yīng)實(shí)質(zhì)化學(xué)反應(yīng)的實(shí)質(zhì)：除了細(xì)胞核tRNA前體(pre-tRNA)的內(nèi)含子是通過

12、直接切割和連接加以去除外，所有的內(nèi)含子都是通過轉(zhuǎn)酯作用(transesterification)實(shí)現(xiàn)剪接的。在每種剪接反應(yīng)中起催化作用的分子可以是各不相同的。 7.4 RNA拼接的一般特點(diǎn)（1）具有一個(gè)專門的剪接系統(tǒng) 高級(jí)真核生物核RNA內(nèi)含子的去除要依賴于一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，這個(gè)系統(tǒng)主要要識(shí)別內(nèi)含子與外顯子的交界處的特殊DNA序列和內(nèi)含子內(nèi)部的特殊DNA序列。 這個(gè)系統(tǒng)包括一系列的組成元件，由蛋白質(zhì)，核糖核蛋白、RNA等共同構(gòu)成一個(gè)所謂的（剪接體）拼接體spliceosome。（2）某些內(nèi)含子的刪除又有RNA自身完成的特點(diǎn)。具有這種性質(zhì)的內(nèi)含子有兩類，分別位于不同的位置并且具有不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（

13、3）不同類型的內(nèi)含子的切除方式是不同的，比如tRNA的內(nèi)元的切除比較簡(jiǎn)單，就是直接的切割和連接，而其他內(nèi)元的切除則通過磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)完成(transesterification) 。（4）具有自我切割功能的內(nèi)含子又往往具有可移動(dòng)性，也就是說這些內(nèi)含子被切除之后可以插入到新的位置。作業(yè)布置：1、下列有關(guān)TATA盒(Hognessbox)的敘述,哪個(gè)是正確的: A.它位于第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因處B.它和RNA聚合酶結(jié)合 C.它編碼阻遏蛋白 D.它和反密碼子結(jié)合2. 轉(zhuǎn)錄需要的原料是:A. dNTPB. dNDP C. dNMP D. NTP E . NMP3、DNA模板鏈為 5-ATTCAG-3 , 其轉(zhuǎn)

14、錄產(chǎn)物是: A. 5 -GACTTA-3 B. 5 -CTGAAT-3 C. 5 -UAAGUC-3 D. 5 -CUGAAU-3 4、 DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程有許多相同點(diǎn),下列描述哪項(xiàng)是錯(cuò)誤的? A.轉(zhuǎn)錄以DNA一條鏈為模板,而以DNA兩條鏈為模板進(jìn)行復(fù)制 B. 在這兩個(gè)過程中合成均為5-3方向 C. 復(fù)制的產(chǎn)物通常情況下大于轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物 D. 兩過程均需RNA引物 5、真核生物的mRNA加工過程中,5端加上（ ），在3端加上（ ），后者由（ ）催化。如果被轉(zhuǎn)錄基因是不連續(xù)的，那么，（ ）一定要被切除，并通過（ ）過程將（ ）連接在一起。6、10位的（ ）區(qū)和35位的（ ）區(qū)是RNA聚合酶與啟動(dòng)

15、子的結(jié)合位點(diǎn)，能與因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。 7、決定基因轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)頻率的 DNA 元件是 （ ） ，它是 （ ）的結(jié)合位點(diǎn) 8、原核生物 RNA 聚合酶核心酶由（ ）組成，全酶由 （ ）組成。9、下面那一項(xiàng)不屬于原核生物mRNA的特征（ C ） A：半衰期短B：存在多順反子的形式 C：5端有帽子結(jié)構(gòu) D：3端沒有或只有較短的多聚（A）結(jié)構(gòu) 10、比較RNA轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制，下列哪些是正確的？ A.都在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行 B.轉(zhuǎn)錄是連續(xù)的 C.鏈的延長(zhǎng)均為53 D.與模板鏈的堿基配對(duì)均為GC 11、真核細(xì)胞中的mRNA帽子結(jié)構(gòu)是（ ） A. 7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸 B. 7-甲基尿嘧啶核苷三磷

16、酸 C. 7-甲基腺嘌呤核苷三磷酸 D. 7-甲基胞嘧啶核苷三磷酸 12、下面哪一項(xiàng)是對(duì)三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的正確描述（ B ） （A）因子、核心酶和雙鏈DNA在啟動(dòng)子形成的復(fù)合物 （B）全酶、模板DNA和新生RNA形成的復(fù)合物 （C）三個(gè)全酶在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)形成的復(fù)合物 （D）因子、核心酶和促旋酶形成的復(fù)合物 13：原核生物和真核生物mRNA的不同？ 原核生物mRNA常以多順反子的形式存在。真核生物mRNA一般以單順反子的形式存在。 原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯一般是偶聯(lián)的，真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體則需經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工，加工為成熟的mRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成信息體后才開始工作 。 原核生物mRNA半壽期很

17、短，一般為幾分鐘 ，最長(zhǎng)只有數(shù)小時(shí)（RNA噬菌體中的RNA除外）。真核生物mRNA的半壽期較長(zhǎng)， 如胚胎中的mRNA可達(dá)數(shù)日。 原核與真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也不同。 原核生物mRNA一般5端有一段不翻譯區(qū)，稱前導(dǎo)順序，3端有一段不翻譯區(qū)，中間是蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，一般編碼幾種蛋白質(zhì)。真核生物mRNA（細(xì)胞質(zhì)中的）一般由5端帽子結(jié)構(gòu)、5端不翻譯區(qū)、翻譯區(qū)（編碼區(qū)）、3端不翻譯區(qū)和3端聚腺苷酸尾巴構(gòu)成分子中除m7G構(gòu)成帽子外，常含有其他修飾核苷酸，如m6A等。真核生物mRNA通常都有相應(yīng)的前體。從DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可稱作 原始前體（或mRNA前體）。一般認(rèn)為原始前體要經(jīng)過hnRNA核不均

18、-RNA的階段，最終才被加工為成熟的mRNA。 課后小結(jié)：按照傳統(tǒng)的觀點(diǎn)，RNA只是基因表達(dá)的中間物，RNA的主要功能是控制蛋白質(zhì)的生物合成。1981年Cech T發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA前體能通過自我拼接切除內(nèi)含子，表明RNA也具有催化功能，稱之為核酶。隨后Altman S證明，RNase P中的RNA（M1 RNA）在適當(dāng)條件下（高濃度Mg2+或存在多胺化合物）單獨(dú)也具有加工tRNA5端的催化活性。他們的研究結(jié)果不僅破除了“酶一定是蛋白質(zhì)”的傳統(tǒng)觀點(diǎn)，而且也破除了“RNA的功能只是控制蛋白質(zhì)的合成”這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)。因此他們于1989年共同獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。此后RNA的重要功能不斷有新的發(fā)現(xiàn)。從而認(rèn)識(shí)到，DNA是攜帶遺傳信息分子，蛋白質(zhì)是執(zhí)行生命功能的分子，RNA則既