RACE不用試劑盒

1、5race 現(xiàn)在的通用方法是根據(jù)CLONTECH SMART RACE kit 改進而來的方法那個試劑盒很坑爹的，價格高的離譜。其實在實驗過程中完全沒有必要買試劑盒，下面我來告訴你怎么玩。原理：5race的關(guān)鍵目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。方法就是在反轉(zhuǎn)錄的過程中人為的在5端加上接頭，然后利用接頭上面的特異序列作為引物和你已知序列上面的一段引物擴增cDNA片段，就能得到5未知序列片段。方法：在反轉(zhuǎn)錄的過程中加入5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3這個接頭引物。在反轉(zhuǎn)錄之后這段序列就會位于整個mRNA反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA的最前端。為什么？MMLV反轉(zhuǎn)錄酶有

2、一種特性就是在反轉(zhuǎn)錄到序列末端的時候加上三個C來終止這個反轉(zhuǎn)錄過程，利用這添加上去的CCC和上面給你的那個接頭引物的GGG堿基配對，MMLV就會以上面那個引物為模版將反轉(zhuǎn)錄出來的第一鏈繼續(xù)延伸出接頭引物的互補鏈，從而形成一個帶接頭的cDNA 5-末端。這個就是RACE的核心原理。具體不明白的看看這篇說明書就好，GOOGLE一搜，結(jié)果滿天飛的，我就不給你傳文件了。SMART RACE cDNA Amplification Kit User Manual你肯定有一下問題1.上面給你的那個接頭引物能不能換掉。上面那個引物看起來好像很普通，其實里面大有玄機，如果你用DNAMAN軟件預(yù)測一下引物的二級結(jié)

3、構(gòu)就可以發(fā)現(xiàn)，這個引物自身能形成一個類似老虎鉗子的形狀，而且僅僅只有GGG三個核苷酸暴露在外面用來和MMLV添加出來CCC配對。所以這個引物的設(shè)計是非常巧妙的。不建議你更換，而且你換掉以后自己要在你實驗動物的基因組中驗證是否存在相同或互補序列，這也是另一個問題。2.是不是用普通的方法合成該接頭引物即可。答曰，可以。clontech公司提供的試劑盒里面的這段引物其實并非全是單鏈DNA，用于配對的那關(guān)鍵的GGG用的是RNA單鏈，為什么？原因是DNA-RNA的結(jié)合能力強于DNA-DNA。明白了把，所以那個用來坑中國人錢的試劑盒提供的引物是很容易降解的，一旦那三個G降解掉了，好了，這8K+盒子就報銷了

4、。值得慶幸的是用全DNA引物是完全能滿足RACE需求的。所以，隨便找個單位合成一下這引物就可以了。3.是不是所有的反轉(zhuǎn)錄酶都可以答曰，不是。RACE的核心技術(shù)就是MMLV延伸的CCC。別的酶不具有這種特性。4.其他方法其他方法有很多，例如傳統(tǒng)的方法，那種利用5帽子結(jié)構(gòu)篩選完整mRNA然后去帽子加接頭的方法肯定是最好的。因為嚴(yán)格的說只有這種方法做出來的才真正稱得上是準(zhǔn)確的RACE。但是，同學(xué)，這方法麻煩，而且，價格不菲。這個貴是很有道理的，里面那么多種酶呀5.實驗要求RNA的質(zhì)量一定要好，越少的末端降解你得到的5RACE結(jié)果就是越準(zhǔn)確的。6.中間已知序列特異性引物的設(shè)計，這個很容易，用prime

5、r 5 在已知序列里面隨便挑一個分數(shù)高點的一般就行，實在不放心的話可以和接頭引物配下對，看看有無引物二聚體，根據(jù)經(jīng)驗，一般沒有。3-RACE相對來說要好做的多，以前我也用寶生物的試劑盒，沒出過問題。但現(xiàn)在都是直接合成引物，反轉(zhuǎn)錄后直接擴增，現(xiàn)在告訴樓主一種新方法：QT：CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTT TTTTTTTQ0：CCAGTGAGCAGAGTGACGQ1：GAGGACTCGAGCTCAAGC因為RNA的3末端加有polyA尾巴，用上面加一通用引物的QT引物做反轉(zhuǎn)錄，也即取代之前的Oligo dT，得到的cDNA除了有poly(T

6、)外，還有兩個通用引物，然后用Q0作外向PCR，Q1做內(nèi)向PCR，上游引物用你的基因特異性引物就行了。SMART 5-RACE的原理是先是利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以O(shè)ligo(dT)18MN作為錨定引物在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達到第一鏈的5末端時自動加上3一5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物（例如 5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3）配對后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（Universal Primer）（例如5 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3）作為上游引物，用一個基因特異引物2（Gene Specific Primer 2，GSP2）作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模