薄層法檢驗操作規(guī)程

1、目 的：建立薄層掃描法的標準操作規(guī)程范 圍：本規(guī)程適用于薄層掃描法。職 責：檢驗員、QC主任。依 據(jù)：中國藥典2010年版。內(nèi) 容：1 簡述薄層色譜掃描法是指用一束一定波長、一定強度的紫外或可見光對薄層板進行掃描，測定薄層板上的樣品斑點對光的吸收強度或斑點經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強度。所得到的圖譜及積分數(shù)據(jù)可用于藥品的鑒別、檢查及含量測定。薄層色譜掃描法可分為吸收法與熒光法。掃描時測定薄層板上的樣品斑點對光的吸收強度的方法稱為吸收法；測定樣品斑點經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強度的方法稱為熒光法。吸收法測定可采用反射法或透射法兩種方式進行掃描。反射法是指測定樣品斑點對照射光的反射情況進行測定的方法；透射法則

2、是測定照射光穿透樣品斑點后光的吸收情況。熒光法測定均采用反射法。透射法大多用于凝膠色譜的掃描，非透明介質(zhì)薄層板的掃描主要為反射式吸收法或熒光掃描法。薄層色譜掃描可使用單波長和雙波長進行測定。單波長薄層掃描適合于分離度好，背景干擾小的薄層色譜。雙波長薄層掃描時用測定波長和參比波長分別掃描薄層板，測定樣品斑點在兩波長下的吸收度之差，可減少分離度欠佳的組分間的相互干擾，并減少薄層板的背景干擾，操作時應(yīng)選擇待測斑點無吸收或最小吸收的波長作為參比波長。根據(jù)掃描時光束的軌跡不同，薄層色譜掃描又可分為線性掃描和鋸齒掃描。線性掃描時一般采用一束比待測斑點略寬的狹窄光帶沿展開方向做單向等速掃描，它適于形狀較規(guī)則

3、斑點的掃描。鋸齒掃描是使用微小正方形光束沿展開方向掃描的同時，在垂直于展開方向進行往復式掃描，掃描過程中光束的運動軌跡呈鋸齒形或矩形，它對于形狀不規(guī)則或分布不均勻的斑點掃描重復性較好，但掃描速度較慢。在采用反射式吸收法測定時，入射光照射到薄層板上，一部分光透射過薄層板，一部分光發(fā)生反射，此外還產(chǎn)生大量的散射光。因此，薄層掃描定量一般不符合Lambert-Beer定律，其樣品量與反射光強度符合Kubelka-Munk方程： (1-R)2/R=2.303C/S其中R為反射光強，為樣品吸收系數(shù)，C為樣品濃度，S為薄層板散射系數(shù)。由此方程可知，樣品吸收系數(shù)和薄層板散射系數(shù)均可影響薄層掃描反射法定量的工

4、作曲線方程。2 儀器2.1 儀器組成薄層掃描儀主要由光源、單色器、薄層板臺、檢測器以及工作站組成。2.1.1 光源在可見光區(qū)域主要使用鎢燈（370700nm），紫外區(qū)多使用氘燈（200370nm）。此外還有汞燈，氙燈等。其中汞燈為線光源，可發(fā)射特征輻射光譜。2.1.2 單色器用來提供一定波長的單色光。其結(jié)構(gòu)與一般的紫外分光光度計類似，通常由入射狹縫、出射狹縫、平行光裝置、色散元件等組成。薄層掃描儀多采用光柵為其色散元件。2.1.3 薄層板臺 掃描時薄層板固定于薄層板臺上，薄層板臺可橫向及縱向移動，以完成對整塊薄層板的掃描。2.1.4 檢測器 多采用光電倍增管。此外還有監(jiān)測入射光能量的參比光電倍

5、增管，以減少入射光強度變化對掃描結(jié)果的影響。2.1.5 工作站 可設(shè)定儀器參數(shù)，接收并存儲掃描結(jié)果，進行積分和其他計算。2.2 儀器性能檢定2.2.1 波長準確度的檢查可利用汞燈的特征譜線光譜對儀器的波長準確度進行檢查。選取汞燈，在200700nm波長范圍內(nèi)以熒光方式對空白硅膠. 薄層板掃描吸收圖譜，圖譜中的峰位波長與汞燈的譜線中相應(yīng)波長的差即為儀器波長準確度。汞燈譜線的已知波長為253.6,313.0,334.2,365.0,404.7,435.8,546.1,578.0nm。在CAMAG等儀器的工作站中有專用的儀器檢定軟件，按要求操作即可自動進行儀器波長準確度等檢查。其結(jié)果應(yīng)符合儀器相應(yīng)的

6、有關(guān)規(guī)定。日常工作中波長準確度的初步核對可采用以下方法：于硅膠G薄層板上點樣10l濃度約為10mg/ml的磷酸氯喹水溶液，用氘燈以反射方式對樣品斑點作光譜掃描（200360nm），掃描所得的譜圖應(yīng)在 (25710)nm 和(34310)nm處有最大吸收峰。2.2.2 重復性測定對薄層板上同一斑點重復多次掃描，計算結(jié)果的標準偏差。取脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品適量，加無水乙醇制成每ml含1mg的溶液。取1l點于硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（4: 3:0.4）為展開劑，展開，取出，晾干。按雙波長薄層色譜掃描法，連續(xù)掃描10次，掃描波長：S=263nm,R=370nm，以峰面積積分值計

7、算相對標準偏差，鋸齒掃描應(yīng)1.5%，線性掃描應(yīng)2.0%。3 操作方法3.1 樣品前處理 應(yīng)按各品種項下規(guī)定，制備供試品和對照品溶液。如進行薄層色譜掃描定量，則取樣不少于2份，平行操作。3.2 薄層色譜操作 應(yīng)照薄層色譜法標準操作規(guī)范操作，保證薄層色譜質(zhì)量。3.3 樣品測定測定時應(yīng)按各品種項下的具體規(guī)定，依據(jù)不同儀器的結(jié)構(gòu)特點及使用說明，正確選擇儀器參數(shù)進行掃描。3.4 系統(tǒng)適用性試驗按各品種項下要求進行，包括檢測靈敏度（用于限量檢查）、分離度和重復性，應(yīng)符合規(guī)定。3.4.1 檢測靈敏度 系指用于限量檢查時，被測成分能被檢出的最低量。一般采用對照品溶液與稀釋若干倍的對照品溶液在規(guī)定的色譜條件下，

8、于同一薄層板上點樣、展開、檢視，后者顯清晰的斑點的點樣量為檢測靈敏度。3.4.2 分離度 用于鑒別時，對照品溶液與供試品溶液色譜中相應(yīng)的主斑點，均應(yīng)顯示兩個清晰分離的斑點。用于限量檢查或含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度（R）的計算公式為：R=2(d2-d1)/(W1+W2)式中 d2為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離；d1為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離；W1及W2為相鄰兩峰各自的峰寬。除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.0。3.4.3 重復性 系指同一薄層板上同一供試品溶液相同濃度的數(shù)個斑點，掃描結(jié)果的偏差。如薄層板展開后直接掃描，同一薄層板上平行點樣的待測成分斑點（不少于4個點

9、）的峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于3.0%；如需顯色后掃描，其相對標準偏差應(yīng)不大于5.0%。3.5 薄層色譜掃描含量測定反射式吸收法測定時，樣品量與反射光強度不呈直線的線性關(guān)系。但是在一個較窄的范圍內(nèi)，曲線可近似為一條直線，從而采用外標一點法或兩點法定量測定。如在測定范圍內(nèi)工作曲線直線回歸線性關(guān)系較差，可根據(jù)不同儀器采用不同方法進行校正。在島津CS系列薄層掃描儀上，有線性補償器（Linarizer），它可依據(jù)Kubelka-Munk方程用電路系統(tǒng)將彎曲的曲線校正為直線后用于定量。在實驗時應(yīng)根據(jù)薄層板及樣品性質(zhì)正確選擇SX值，防止校正不足或校正太過，影響薄層掃描定量結(jié)果。CAMAG等薄層掃描儀則可使用二次方程曲線表達樣品量與反射光強度之間的關(guān)系，在分析時采用多個濃度對照品測定值回歸計算出二次方程工作曲線，再根據(jù)此工作曲線計算樣品含量。含量測定時供試品溶液和對照品溶液應(yīng)交叉點于同一薄層板上，每份供試品溶液點樣不得少于2個，對照品每一濃度不得少于2個。其計算結(jié)果的相對平均標準偏差應(yīng)不大于5%。4 注意事項4.1 除另有規(guī)定外，薄層色譜掃描法含量測定應(yīng)使用市售薄層板。4.2 薄層色譜分析的各個步驟如點樣、展開等，均會影響薄層掃描結(jié)果的準確性與重現(xiàn)性，因此在實驗的各個步驟均應(yīng)規(guī)范操作。4.3 掃描時應(yīng)沿展開方向自下而上進行掃描，不可橫向掃描。4.4 測定記錄中應(yīng)包括薄層