第10章--單克隆抗體技術(shù).ppt

1、,第四章 抗體技術(shù),第十章 抗體技術(shù),、抗體類型 1、多克隆抗體(polyclonal antibody) 早期人工制備抗體的主要方法，以相應(yīng)抗原免疫動物，由此產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇（表位）的混合抗體，故稱之為多克隆抗體。, 第二節(jié) 抗體制備,優(yōu)點(diǎn)：來源廣泛、制備容易,缺點(diǎn)：特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng),多克隆抗體,1890年Behring和Kitasato發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素，建立免疫療法，開創(chuàng)了抗體制藥之先河。 白喉外毒素免疫動物抗毒素治白喉,Behring (德,18541917）,目前治療性抗體產(chǎn)品：精制破傷風(fēng)毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。 綠膿免疫血漿抗體制劑,多克隆抗體的制備,

2、根據(jù)不同的免疫原，選擇不同的免疫方案。 免疫方案,免疫途徑,免疫程序,動物選擇,細(xì)胞融合，又稱體細(xì)胞雜交是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過膜融合形成單個(gè)細(xì)胞的過程。 在適當(dāng)?shù)臈l件下，細(xì)胞融合在一起，產(chǎn)生具有原來兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞（hybrid cell）。,2、細(xì)胞融合技術(shù)和單克隆抗體,顯微鏡下細(xì)胞融合過程,Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。 Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。 Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。 Lange于1875年

3、第一個(gè)觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。 1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。 1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。 20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。,細(xì)胞融合研究進(jìn)展,1975年，Kohler和Milstein應(yīng)用小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊細(xì)胞致敏的小鼠脾細(xì)胞融合，得到的一部分融合

4、雜交細(xì)胞既能繼續(xù)生長，又能分泌抗羊紅細(xì)胞抗體，將這種雜交細(xì)胞系統(tǒng)稱為雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)用這種方法可制備單一抗原決定簇的單克隆抗體。,一、何謂單克隆抗體？, 由一個(gè)識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體，稱單克隆抗體,單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology ）。,

5、Niels K. Jerne,G. Kohler,C. Milstein,雜交瘤技術(shù)的基本原理,3、基因工程抗體 基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的抗體分子。,基因工程抗體與單克隆抗體相比的優(yōu)點(diǎn)：,通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應(yīng)。,基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；根據(jù)治療的需要，制備新型抗體。,可以采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。,整體水平抗體生成技術(shù),細(xì)胞工程抗體生成技術(shù),基因工程抗體生成技術(shù),

6、多克隆抗體（抗血清）,單克隆抗體,嵌合抗體、改形抗體,“小型化抗體”（單鏈抗體）,組合抗體庫技術(shù),噬菌體抗體庫技術(shù),Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠,抗體真核表達(dá)技術(shù),經(jīng)過免疫的哺乳類動物單一的B淋巴細(xì)胞，可以合成分泌單一性的抗體，我們稱這種具有特異性的、同質(zhì)性的抗體為單克隆抗體。,二、McAb技術(shù)基本原理,改變B淋巴細(xì)胞遺傳特性建立永久生長和能分泌McAb細(xì)胞系的途徑,病毒轉(zhuǎn)化 細(xì)胞雜交,骨髓瘤細(xì)胞選擇,骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體 選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,*融合細(xì)胞的選擇原理,1964年Litterlefield首先發(fā)明 HAT 選擇性培養(yǎng)

7、基。 H：Hypoanthine 次黃嘌呤 A：Aminopterin 氨基喋呤 T：Thymidine 胸腺嘧啶脫氧核苷 原理：正常細(xì)胞不但具有利用培養(yǎng)液中的谷酰胺和尿核苷單磷酸合成DNA的能力,且當(dāng)這條主要途徑被氨基喋呤（A）阻斷時(shí)，還具有利用培養(yǎng)液中現(xiàn)成的次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）在次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的作用下，借此替代通路來合成DNA的能力。,三、 McAb技術(shù)的特點(diǎn),1、 高度特異性 2 、高度穩(wěn)定性 3 、高抗體活性,4、 不可知性 5、 過于單一性,四 、McA制備的基本方法,（一） 抗原提純與動物免疫,（二） 骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備,對數(shù)生

8、長期的骨髓瘤細(xì)胞SP20(HGPRT缺陷株)的準(zhǔn)備 脾細(xì)胞的準(zhǔn)備,融合前骨髓瘤細(xì)胞:細(xì)胞狀態(tài)渾圓透亮、大小均一、邊緣清晰、排列整齊、呈半致密分布,（三） 細(xì)胞融合,融合過程須注意問題 1、細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞比例為1：4 2、反應(yīng)時(shí)間：混合細(xì)胞的離心管中30s內(nèi)加入1ml 37預(yù)溫的50PEG，邊加邊輕輕搖動離心管，作用90s，然后加入預(yù)溫的37的DMEM不完全培養(yǎng)液終止PEG作用，800r/min離心6min，棄上清。 3、培養(yǎng)液成分,（四）篩選和克隆,有限稀釋法(稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞/孔),（五） 單克隆抗體的制備和凍存,（六） 單克隆抗體的純化,（制備方法：體內(nèi)培養(yǎng)、體外培養(yǎng)）,（

9、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、 親和層析、酸沉淀）,四 、McA制備的基本方法,五 、單克隆抗體的應(yīng)用,1、作為親合層析的配體,2、 作為生物治療的導(dǎo)向武器,3、 作為免疫抑制劑,通過親和層析可從復(fù)雜的混合物中分離、純化某一特定成分,McAb所帶藥物只作用于靶組織器官,抗人的T淋巴細(xì)胞單抗用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng),4、作為研究工作中的探針,5、增強(qiáng)抗原的免疫原性,6、作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑,（1）診斷各類病原體 （2）腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原檢測 （3）檢測淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志 （4）機(jī)體微量成分的測定,CJ PEB1重組蛋白的表達(dá)及單克隆/多克隆抗體的制備鑒定,課題的思路及目的,

10、誘導(dǎo)培養(yǎng)基因工程菌E.coli BL21(DE3) 高效表達(dá)CJ PEB1重組蛋白,鎳瓊脂糖層析柱純化 表達(dá)后的重組蛋白,免疫BALB/C小鼠制備單抗,免疫新西蘭兔制備多抗,為建立血清學(xué)方法 檢測CJ創(chuàng)造條件,PEB1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定,常規(guī)免疫BALB/C小鼠制備單克隆抗體,-a,-b,-c,-d,-a -b -c -d,BALB/C,a,b,b,c,d,脾臟產(chǎn)生各種 B 細(xì)胞,與佐劑乳化,免疫,采血收集血清作為篩選時(shí)陽性對照,無菌取脾臟收集B細(xì)胞,抗原通常有多個(gè)抗原決定簇,免疫后 的脾臟,約在兩月內(nèi) 注射四次,PEB1蛋白,PEB1 蛋白,ELISA,HAT,PEG 細(xì)胞融合,雜交

11、瘤細(xì)胞,（亞克?。?(確定只有單個(gè)細(xì)胞),-d,-c,-b,-a,-d,培養(yǎng)篩選,只識別一個(gè)抗原決定簇,a,b,b,c,d,合混胞細(xì),選篩,抗單,運(yùn)用小鼠單抗分型試劑盒確定雜交瘤細(xì)胞所分泌的單抗的亞型。 將建株的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔誘生腹水。 應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測的腹水中單抗的效價(jià)。通過Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測單抗的特異性。,三、PEB1蛋白多克隆抗體的制備及鑒定,免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。,1,2,3,4,1,2,4,3,PEB1 蛋白,與佐劑完全乳化,待血凝完全離心收集血清,鹽析法粗提兔IgG抗體,應(yīng)用間接ELISA法和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測多克隆

12、抗體抗體的效價(jià)。 通過Western-blot和玻片凝集試驗(yàn)檢測多克隆抗體的特異性。,結(jié)果,一、SDS-PAGE鑒定純化后的PEB1蛋白,1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10,圖1. SDSPAGE鑒定純化后的PEB1蛋白,表達(dá)的蛋白通過鎳瓊脂糖凝膠層析柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，蛋白質(zhì)分子量大小與預(yù)計(jì)的理論值相符，和本室前期的研究結(jié)果一致， PEB1重組蛋白純度高 。,12：咪唑濃度為50mmol/L時(shí)洗脫的蛋白 34：咪唑濃度為100mmol/L時(shí)洗脫的蛋白 56：咪唑濃度為200mmol/L時(shí)洗脫的蛋白 M ：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量 78:咪唑濃度為300mmol/L時(shí)洗脫的蛋白

13、 910:咪唑濃度為400mmol/L時(shí)洗脫的蛋白,97.4kd,66.2kd,42.7kd,31kd,14.4kd,單克隆抗體的獲得及鑒定,細(xì)胞克隆的形成和雜交瘤細(xì)胞的篩選,圖2. 融合后第二天骨髓瘤細(xì)胞對照孔,圖3. 融合后第二天 細(xì)胞融合孔,圖4. 融合后第三天細(xì)胞融合孔,圖5. 融合后第八天 細(xì)胞融合孔,圖6.間接ELISA篩選抗體陽性孔,通過有限稀釋法和ELISA法進(jìn)行連續(xù)克隆篩選后獲得兩株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1D7A5株和5G2B3株。,圖8. 1D7A5株分泌抗體的亞型,圖9. 5G2B3株分泌抗體的亞型,1D7A5株和5G2B3株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)間接EL

14、ISA法檢測，腹水中的抗體效價(jià)分別為1:8104和1:5104。 兩株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測，腹水中的抗體效價(jià)均為1:8。,免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示：2株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗，可以與PEB1蛋白特異性結(jié)合。通過DAB顯色出現(xiàn)特異性條帶并且無雜帶出現(xiàn)。,1 2 3 4 M,12：未經(jīng)純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合 3 4：純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合 M ：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量,圖10.western-blot檢測單抗特異性,97.4kd,66.2kd,43kd,31kd,20kd,14.4kd,表1.玻片凝集試驗(yàn)檢測單抗的特異性結(jié)果,多克隆抗體的效價(jià)檢測及鑒定,表2.間接

15、ELISA檢測兔血清的效價(jià)變化,間接ELISA檢測兔血清的效價(jià)變化,表3. 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測免疫后的抗體效價(jià)變化,雙向瓊脂擴(kuò)散檢測免疫后的抗體效價(jià)變化,Western-blot試驗(yàn)檢測多抗的特異性,1 2 M,1：未經(jīng)純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合 2：純化的PEB1蛋白與單抗特異性結(jié)合 M：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量,免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：所獲得的多抗與PEB1蛋白特異性結(jié)合。通過DAB顯色出現(xiàn)特異性條帶并且無雜帶出現(xiàn)。,圖11.western-blot檢測多抗特異性,97.4kd,66.2kd,43kd,31kd,20kd,14.4kd,第三節(jié) 抗體蛋白的分離純化,一、 抗體蛋白的提取,水溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法,二、抗體蛋白的分離純化,1、溶解度不同分離,蛋白質(zhì)的鹽析 等電點(diǎn)沉淀法 低溫有機(jī)溶劑沉淀法,2、分子量大小分離,透析與超濾 凝膠過濾（分子篩層析）,3、帶電性質(zhì)不同,電泳法 離子交換層析法,4、配體特異性親和色譜法,鹽析沉淀,用中性鹽類使