普通光學顯微鏡的原理與使用.ppt

1、普通光學顯微鏡原理與使用,河北大學細胞生物學實驗室,主要內容,顯微鏡的發(fā)展 顯微鏡的光學原理 顯微鏡的幾個基本概念 顯微鏡的結構 顯微鏡的使用 顯微鏡的維護,要知道的幾個重要的分辨率,人眼：0.2mm/250mm 光學顯微鏡：0.2um 電子顯微鏡：0.2nm,1.顯微鏡的發(fā)展,1.1 人眼：人眼觀察物體的能力是有限的。一般的情況下，在25cm的明視距離內，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的兩個物體。也就是說，當兩個物體相距不到0.1mm的時候，人眼就會把它們看成是一個物體了。這個極限便稱為人眼的分辨本領。 人眼視錐細胞直徑為4微米，對應的視角約為30秒，這個角度就是視角的極限。一般要能清晰

2、的分辨兩個點，視角須在1分以上。高1米的物體距眼睛3400米時，視角為1分。,1.2 放大鏡：約在四百年前眼鏡片工匠們開始磨制放大鏡。當時的放大鏡的放大倍數(shù)只有35x 1.3 顯微鏡： 1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者造出類似顯微鏡的放大儀器。 16731677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡 19世紀70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎。 1850年出現(xiàn)了偏光顯微術； 1893年出現(xiàn)了干涉顯微術； 1935年荷蘭物理學家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術，,羅伯特虎克制造的顯微鏡（1665）放大倍數(shù)：140倍,列文虎克和他的顯微鏡（約1680）,2 顯微鏡的光學原理,2

3、.1折射和折射率 光線在均勻的各向同性介質中，兩點之間以直線傳播，當通過不同密度介質的透明物體時，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質的傳播速度不同造成的。,2.2凸透鏡的五種成象規(guī)律(1) 當物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內、焦點以外形成縮小的倒立實象； (2) 當物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象； (3) 當物體位于透鏡物方二倍焦距以內，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象； (4) 當物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象； (5) 當物體位于透鏡物方焦點以內時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側比物體遠的位置

4、形成放大的直立虛象。,2.3顯微鏡的成像原理 顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。 物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像AB。 AB靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像AB后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。,3 顯微鏡的幾個基本概念,3.1 光源：能發(fā)射光波的物體。 可見光頻率范圍：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中對應的波長

5、范圍：390nm 760nm 相應光色：紫、藍、青、綠、黃、橙、紅,3.2分辨率(鑒別距離)：顯微鏡能分辨的最小距離，用D表示。顯微鏡的鑒別距離越小，分辨率越高。 D=0.61/ nsin D：分辨率 :光波的波長 N:介質折射率 :物鏡鏡口角 3.3孔徑角：由標本上一點發(fā)出的進入物鏡最邊緣光線L和進入物鏡中心光線OA之間的夾角稱為孔徑角。 3.4數(shù)值孔徑：令NA = nsin , 叫物鏡的數(shù)值孔徑。 數(shù)值孔徑與顯微鏡的分辨率有密切關系，越短，NA越大，分辨率越高。,物鏡數(shù)值孔徑,3.5放大率 在顯微鏡下所看到的物像和實際物體之間的大小比例叫顯微鏡的放大率或放大倍數(shù)。顯微鏡下物像的放大主要由物

6、鏡、鏡筒長度、目鏡所決定。適合的放大倍數(shù)決定于物鏡的數(shù)值孔徑，一船應為數(shù)值孔徑的5001000倍。 3.6像差,像差,球差,象散,慧差,場曲,負畸變,正畸變,色差,球差校正,色差校正,3.7焦點深度 在顯微鏡的光軸上有一段距離范圍內物體被看得清晰。超出這段距離的物體就模糊不清。這段距離位于顯微鏡焦點的上下很小的范圍之內。這段距離的上下限叫焦點深度。,焦點深度,3.8視場數(shù) 目鏡中觀察到的物像的一定范圍叫視野。 顯微鏡的總放大率小的時候所能看到的標本的范圍大，而總放大率愈大所能看到的標本的局部愈小。所以說視野與顯微鏡的總放大率成反比。 在同一總放大率的條件下視野也可有大小差別。這種差別決定于目鏡

7、的某些性能。首先目鏡的視場光欄的直徑是最主要的條件。視場光欄的直徑叫目鏡的視場數(shù)值,3.9工作距離 工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。 在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。 數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。,點光源經(jīng)過光學儀器的小圓孔后，由于衍射的影響，所成的像不是一個點，而是一個明暗相間的衍射圖樣，中央為愛里斑。,s1,s2,D,*,*,愛里斑,瑞利判據(jù)：當一個點光源的衍射圖樣的中央最亮處剛好與另一個點光源的衍射圖樣的第一級暗紋相重合時，這兩個點光源恰好能被分辨。,提高顯微鏡分辨率的方法：,（1）增大物鏡的數(shù)值孔徑 在物鏡和蓋玻片之間充以n 較大的

8、油，如香柏油n =1.52,不僅使n 增大，而且孔徑角 也增大。 （2）用短波長的光照射 如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。,4 顯微鏡的結構,組成,光學放大系統(tǒng),照明系統(tǒng),機械和支架系統(tǒng),物鏡,光源,折光鏡,聚光鏡,濾光片,目鏡,光學顯微鏡基本結構： 1. 照明燈(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 載物臺和切片夾(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推進器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物鏡(Objectives) 6. 粗細螺旋(Course and fine focus knob)

9、 7. 目鏡(Oculars) 8. 照相機等接口(Connection to camera, etc.),4.1物鏡 物鏡(objective)是光學顯微鏡成像系統(tǒng)中決定其分辨率或叫分辨本領的最關鍵部件。 (1)消色差物鏡(achromat) 色差校正使可見光中紅光和藍光聚焦于一點，而黃綠光則聚焦于另一點。能夠消除光譜中紅光和藍光所形成的色差。這種物鏡與目鏡配用時可達到消色差物鏡所要求的光學性能。 (2)復消色差物鏡(apochromat) 是性能最高的物鏡。能消除可視光中黃、紅、藍即包括幾乎所有譜線在成像過程中所造成的色差。,(3)平象物鏡 它們所成的影象基本上是平的，象場彎曲很小，不會發(fā)

10、生視野中心與邊緣不能同時準焦的現(xiàn)象，因此對目視觀察及顯微攝影都極為方便。平象物鏡由于將彎曲的影象展平，在同樣放大倍數(shù)下它成的影象比用一般物鏡要大一點。在平象物鏡的金屬外框上，刻有Flanachr、 planapo、 plan 等字樣。 (4)相差物鏡 相差物鏡(Phasencontrast objective)的一個透鏡片上噴涂著一層環(huán)狀金屬膜板叫相位板。相位板是相差顯微鏡的關鍵部件。它和相差顯微鏡的聚光鏡上的的環(huán)狀光欄相配合使用。有關位相板涂料的性質和作用原理在以后詳述。 外殼上刻有Ph標記,物鏡結構,低倍物鏡,物鏡標識,無限遠光學系統(tǒng),4.2目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大的實象再放大一級，并

11、把物象映入觀察者的眼中，實質上目鏡就是一個放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對于物鏡不能分辨出的結構，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。 4.3聚光鏡 聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。,聚光鏡光欄 所謂光欄，從廣義的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可認為光欄。 聚光鏡光欄作用 （1）改變聚光鏡的數(shù)值孔徑以便與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，可調整圖象的分辨率和反差。 （2）輔助調整

12、亮度。,聚光器數(shù)值孔徑,5 光學顯微鏡的使用,實驗時要把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應距桌沿 67 cm左右。 打開光源開關，調節(jié)光強到合適大小。 轉動物鏡轉換器，使低倍鏡頭正對載物臺上的通光孔。 將所要觀察的玻片放在載物臺上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。 先用低倍鏡觀察（4X）。觀察之前，先轉動粗動調焦手輪，使載物臺上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，然后，通過目鏡觀察，并轉動粗調焦手輪，使載物臺慢慢下降，直到看清物像。,如果像偏離視野，可慢慢調節(jié)載物臺移動手柄。 瞳距調節(jié)：左右推拉目鏡，使兩目鏡距離與自己兩眼距離相等。 屈光度調節(jié) 高倍物鏡觀察：把物

13、像中需要放大觀察的部分移至視野中央。將高倍物鏡轉入光路（一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時，換高倍物鏡應可以見到物像，但物像不一定很清晰），微動調焦手輪進行調節(jié)。 根據(jù)需要調節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時，視野要稍變暗一些，所以需要調節(jié)光線強弱）。 觀察完畢，應先將物鏡鏡頭從通光孔處移開，并檢查物鏡是否沾水沾油，檢查處理完畢后即可裝箱。,瞳距調節(jié),屈光度調節(jié),6 光學顯微鏡的維護,顯微鏡要輕拿輕放。 嚴禁將表面有水的載片放到顯微鏡上。 從低倍轉入高倍應能看到圖象，否則需轉入低倍另行調節(jié)、查找原因。 每次使用完畢后將將光源亮度調至最低。 臨時不用顯微鏡只需將光源亮度調至最低而無需關閉。忌頻繁開關顯微鏡電源。 鏡頭臟污只能用專用工具經(jīng)專門程序清洗。 使用完畢等燈箱冷卻后罩上防塵罩或放入箱內，并存于干燥無塵處。,清潔工具,清潔液配方：1份無水乙醇3份乙醚,擦拭方法,注意,塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。 嚴禁用干擦鏡紙擦拭鏡頭。 物鏡嚴禁拆卸并防止振動。 打開