蛋白質(zhì)電泳技術(shù)介紹

1、電泳技術(shù)介紹,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE),基本原理,1.SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。 2.蛋白質(zhì)樣品在100用SDS和還原劑處理，可解聚成亞基,加入SDS，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。 3.各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物均帶相同密度的負(fù)電荷，其荷電超過了原蛋白質(zhì)，消除了不同蛋白質(zhì)的荷電差異。,圖解,多孔凝膠,混合大分子,電泳,操作流程,制膠,上樣,電泳,染色,脫色,制膠 1將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干，把玻璃板在灌膠支架上固定好 2 按照配方制

2、備分離膠，TEMED在灌膠前加入混勻，迅速灌膠 3 在分離膠上迅速并輕柔的加上水或無水乙醇進(jìn)行水封（凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面） 4 倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干,按比例配好濃縮膠,連續(xù)平穩(wěn)加入濃縮膠至離邊緣5mm處,迅速插入樣梳,靜置40分鐘,具體步驟,上樣 按一定順序在加樣孔中加入樣品，根據(jù)SDS-PAGE電泳玻璃板 間隙厚度不同，選擇加入樣品量。 電泳 打開電源將電壓調(diào)到80v（一般15min左右），待樣品跑過壓 縮膠后將電壓調(diào)到120v至樣品電泳到膠底部為止。,染色 將凝膠小心取下放入容器中，加入染色液（考馬斯亮藍(lán) ），用搖床搖23h 脫色 待條帶清晰后倒出染色液，

3、加入脫色液過夜。將脫色液倒掉 ，可以用Quality One，或者相應(yīng)的成像系統(tǒng)拍照、分析、 估算蛋白濃度。,等電聚焦電泳 (Isoelectro focusing IEF or EF),等電聚焦電泳 ，是利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可到達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。 適用: 1.研究蛋白質(zhì)微觀不均一性 2.測定蛋白質(zhì)等電點(diǎn),基本原理,Company Logo,用電流在凝膠溶液中建立一個(gè)穩(wěn)定的PH梯度,蛋白質(zhì)移動(dòng)到它們各自的等電點(diǎn)，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)被分開,Company Logo,pH梯度構(gòu)建,載體兩性電解質(zhì)p

4、H梯度 (Carrier ampholytes pH gradients，CA):在電場中通過兩性緩沖離子建立的pH梯度。 固相pH梯度（immobilized pH gradients，IPG） 將緩沖基團(tuán)共價(jià)鍵合在介質(zhì)上成為凝膠介質(zhì)的一部分而建立pH梯度（線性和非線性），分辨率比前者高一個(gè)數(shù)量級。,載體兩性電解質(zhì)（CA）應(yīng)具備的條件,(1)在等電點(diǎn)處必需有足夠的緩沖能力 (2)在等電點(diǎn)必需有足夠高的電導(dǎo) (3)分子量要小，便于與被分離的高分子物質(zhì)用透析或凝膠過濾法分開。 (4)化學(xué)組成應(yīng)不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。 (5)應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。,操作流程,1,2,3,4,制膠,裝

5、管,裝槽，電泳,剝膠,5,固定,測定pH梯度,具體步驟,1. 配膠 2. 裝管 每個(gè)學(xué)生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然后將圓 盤電泳槽的玻璃管洗凈，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂 直放在試管架上，用移液管將配好的膠液移入管內(nèi)，（每根 玻璃管的容量約為1.5-1.8ml）,液面加至距管口1mm處，用 注射器輕輕加入少許H2O，進(jìn)行水封，以消除彎月面使膠柱 頂端平坦。膠管垂直聚合約30分鐘，聚合完成時(shí)可觀察到水 封下的折光面。,3. 裝槽和電泳 用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤電泳槽內(nèi)，調(diào)節(jié)好各管的高度，記下管號。每支管約1/3在上槽，2/3在下槽

6、。上槽加入500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹沒各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負(fù)極，開啟電泳儀，恒壓160V，聚焦2至3小時(shí)，至電流近于零不再降低時(shí)，停止電泳。,4. 剝膠 取下膠管，用H2O 將膠管和兩端洗2次，用注射器沿管壁輕 輕插入針頭，在轉(zhuǎn)動(dòng)膠管和內(nèi)插針頭的同時(shí)分別向膠管兩端 注入H2O少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕 擠出。膠條置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，記住正極端為“頭”，負(fù)極 端為“尾”，若分不清時(shí)，可用pH試紙鑒定，酸性端為正，堿 性端為負(fù)。,5. 固定 取2支膠條置于一個(gè)小培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入10%三氯乙酸溶液

7、至沒過膠條，進(jìn)行固定，約半小時(shí)后，即可看到膠條內(nèi)蛋白質(zhì)的白色沉淀帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長度“L2”和正極端到蛋白質(zhì)白色沉淀帶中心（即聚焦部位）的長度“L”。 固定后的膠條可在康強(qiáng)860紫外/可見分光光度計(jì)上用280nm或238nm波長作凝膠掃描，然后用掃描圖作相應(yīng)的測量和計(jì)算。,6. 測定pH梯度 將放在另一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)未固定的膠條，用直尺量出待測pH膠條的長度“L1”。按照由正極至負(fù)極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成10mm長的小段，分別置于小試管中，加入1ml H2O，浸泡半小時(shí)以上或過夜，用仔細(xì)校正后的帶細(xì)長pH復(fù)合電極的pH計(jì)測出每管浸出液的pH值。,優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：分

8、辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，不僅可測定蛋白或多肽的等電點(diǎn)而且能將不同等電點(diǎn)的混合生物大分子進(jìn)行分離和鑒定 。 缺點(diǎn)：需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。,雙向電泳 （2-D electrophoresis）,Company Logo,基本原理,第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離（將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度），至各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離。,第一向：等電聚焦電泳,第二向：SDS-PAGE,水平方向：反映出蛋白在pI上的差異 垂直方向：反映出它們在分

9、子量上的差別,圖解,2D電泳操作流程,挖點(diǎn) 酶解 點(diǎn)靶,蛋白鑒定,分離,雙向電泳 第一向 第二向,圖譜分析,圖像獲取 圖譜分析,1.樣品制備 2.固相預(yù)制膠條的水化 3.第一向等電聚焦 3.1. 取出IPG預(yù)制膠條（7cm pH 4-7），室溫平衡。 3.2. 在聚焦盤或水化盤中加入樣品。 3.3. 去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層 。,具體步驟,3.4. 將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中 。 3.5. 在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。 3.6. 對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。 3.7. 設(shè)置等電聚焦程序。 4.膠條的平衡 4.1冰箱中取出的膠條，于室溫放置10分鐘。,4.2配制膠條平衡緩沖液 I 。 4.3吸去膠條上的礦物油及多余的樣品。 4.4第一次平衡。振蕩15分鐘。 4.