脂肪酶淀粉酶測(cè)定方法

1、脂肪酶測(cè)定采用p-NPP法取0.5g樣品，加去離子水10mL，40水浴浸泡2h，過濾。取濾液1mL于試管中，加入pH8.0緩沖液3mL和1mmol/L p-NPP溶液0.1mL于40下精確反應(yīng)3min，迅速置于冰上終止反應(yīng)。在波長405nm處測(cè)定吸光度值。對(duì)照管酶液用等體積去離子水代替，其余試劑相同。 Npp標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=0.287x+0.0861（y：吸光度 x：NPP濃度（umol/L）試劑配制：1mmol/L p-NPP溶液：稱取0.0378g pNPP，加入1mL曲拉通-100與5mL異丙醇，用Tris-HCL（pH8.0）定容至100mL。pH8.0 Tris-HCl：50mL 0.

2、1M tris堿溶液與29.2mL 0.1M HCl溶液混合，加蒸餾水定容至100mL。淀粉酶測(cè)定稱取六神曲0.5g，研細(xì)，用20mL去離子水40浸泡1h，過濾。取2只250mL的碘瓶，各加入5%的淀粉液25mL，10mL醋酸鈉緩沖液（pH4.5），10mL蒸餾水，搖勻，40水浴預(yù)熱5min。A管中加入濾液5mL，準(zhǔn)確反應(yīng)1h，立即加2mol/L HCl 1mL終止反應(yīng)，B管中先加入HCl，再加濾液5mL。2只碘瓶分別加入0.05mol/L碘液10mL，0.1mol/L氫氧化鈉45mL，邊滴邊振搖，暗處放置20min，加入1mol/L硫酸2mL，用0.1mol/L硫代硫酸鈉滴定至無色。每份樣品

3、測(cè)定3次。記錄消耗硫代硫酸鈉的體積，計(jì)算得淀粉酶活力。淀粉酶活力是指1g六神曲粉末在一定條件下(T=40，pH=5.0)，1h 內(nèi)催化可溶性淀粉水解生成葡萄糖的毫克數(shù)。計(jì)算公式: 淀粉酶活力=c(vBvA)MN/2mt式中:c為硫代硫酸鈉的濃度(mol/L)，M為葡萄糖的摩爾質(zhì)量(g/mol)，N為酶液稀釋倍數(shù)，VA為樣品滴定值(mL)，VB為空白滴定液(mL)，m為六神曲的取樣量(g)，t為反應(yīng)時(shí)間(h)，淀粉酶活力單位為mg/(gh) 。試劑配制pH4.5醋酸鈉緩沖液：18g醋酸鈉加9.8mL冰醋酸，定容至1000mL。1mol/L硫酸溶液：量取6mL濃硫酸，倒入適量水中，用水稀釋至100

4、mL。0.1mol/L碘液：取碘13.0g，加碘化鉀36g與水50ml溶解后，加鹽酸3滴與水適量使成1000ml，搖勻，用垂熔玻璃濾器濾過。蛋白酶活力測(cè)定 稱取六神曲1g，研細(xì)，加蒸餾水20ml，于40水浴放置1h，間斷攪拌，過濾，濾液以磷酸鈉緩沖液稀釋1倍。取1mL稀釋液置離心管中，于 40 水浴預(yù)熱5min，加入預(yù)熱的酪蛋白1mL，保溫10min，立即加入 0.4 mol / L 三氯醋酸 2 ml，終止反應(yīng)，繼續(xù)置水浴中保溫 20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心濾過。取1 mL濾液，加入 0.4 mol/L 碳酸鈉溶液5 mL，福林試液 1 mL，蒸餾水 2 mL，搖勻，置水浴鍋中，40 保溫顯色 20 min。以試劑溶液為空白，于763 nm 波長處測(cè)定吸光度。在40時(shí)每1min水解酪蛋白產(chǎn)生1g酪氨酸的酶量，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=8.0061x+0.0006式中Y為吸光度，x為酪氨酸濃度（g/mL）計(jì)算公式:蛋白酶活力=(y-0.0006) NV/(8.0061 mt)式中: t 反應(yīng)時(shí)間( h) ，m 酶粉的質(zhì)量( g) ，