激光共聚焦顯微鏡的綜述

1、激光掃描共聚焦顯微鏡的綜述 基本原理由于生物研究中免疫熒光技術的應用越來越廣泛，研究人員發(fā)現(xiàn)，當實驗室所用的熒光標本稍厚時，該顯微照片的分辨率較低，由于傳統(tǒng)顯微鏡技術都使用的是場光源，由于標本層次的重疊結(jié)構(gòu)區(qū)別（內(nèi)部細胞結(jié)構(gòu)）就會產(chǎn)生衍射和散射光的干擾，使標本中的多處細胞結(jié)構(gòu)的成像模糊和發(fā)散。激光共聚焦顯微鏡的首先主要是利用激光掃描形成的點光源，加上共聚焦原理，在熒光標記標本的焦平面上各個點的處理,光信號穿透探針小孔到達光電倍增管，再經(jīng)過信號數(shù)字圖像處理觀察、分析和輸出，在計算機監(jiān)視屏上形成圖像。其特點是可以對樣品進行斷層成像，非侵入的觀察三維空間結(jié)構(gòu)。由于光柵針孔和探針孔對物鏡是共軛對稱的，

2、焦平面同時聚焦于光柵針孔和探測針孔。進行點掃描時，逐點掃描后才形成整個標本的光學切片。與聚焦光點相應的光源針孔和觀察針孔必須對準，故稱共聚焦。這樣，大大提高了系統(tǒng)信噪比和成像清晰度。這種技術對于觀察厚的樣品顯得尤為重要。傳統(tǒng)的免疫熒光顯微鏡在厚的樣品中只能看到表面發(fā)出的熒光，LSCM可以深入到樣品內(nèi)部，具體到某一個層面。20多年來，雖然共聚焦顯微鏡的掃描方式使得掃描共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)學領域有了廣闊的用武之地。包括以下幾個方面：多波長激光器產(chǎn)生更明亮的點光源。噪聲很低光學檢測器效率很高的反射鏡。圖像處理大大加快了。視頻顯示技術分辨率大大提高。亮度更大 、更穩(wěn)定的熒光探針激光共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)

3、學中的應用1 定量熒光測定LSCM 通過計數(shù)接收到的光子，進行多次重復的熒光定量分析，和活細胞定量分析。LSCM通過這些方法來對單細胞或細胞群的各種細胞器，結(jié)構(gòu)蛋白，核酸，酶和受體分子等特異性結(jié)構(gòu)的含量與分布進行定量分析，同時還可測定膜電位，氧化還原狀態(tài)等生化反應變化程度。此外， 我們可以用LSCM來完成對細胞內(nèi)的熒光強度 、細胞周長及細胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進行測定 。我們還可以LSCM 可用于細胞骨架裝配、細胞凋亡機制、離子通道的裝配等多個方面的研究 。若我們利用 LSCM 技術，還可以甚至取代傳統(tǒng)的核酸印跡雜交或者蛋白印跡雜交等技術 , 進行基因的表達檢測 , 使得對所觀察基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等測

4、量變得更加準確簡單。熒光原位雜交技術（FISH）是進行基因定位和染色體分析的一項重要技術，它可以和LSCM結(jié)合發(fā)揮更大的作用。LSCM 也可以對 “ 生物芯片” 上每個位點的熒光強度進行實時、靈敏、準確的檢測和定量分析，目前主要應用在基因表達檢測、和基因文庫作圖以及雜交測序等方面2 定量共聚焦圖像分析根據(jù)獲得的細胞光學切片, 可以測定細胞的物理、生物特性的變化, 如核酸含量、分子擴散、胞內(nèi)離子等。例如，我們可以根據(jù)LSCM產(chǎn)生的光學切片圖像，分析正常及癌變細胞中細胞骨架與核之間的關系，對研究癌癥的發(fā)展起到了關鍵作用。3 三維重組分析生物結(jié)構(gòu)LSCM 通過薄層光學斷層成像的功能, 可獲得熒光標本

5、真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機圖像處理及重建三維圖像，我們可以沿軸或任意角度來觀察標本的橫斷面，還可以突出特征，生成整個結(jié)構(gòu)體的三維效果。這讓我們能更直觀地進行形態(tài)學觀察和空間關系。目前流行的三維重建技術可讓我們獲得特定結(jié)構(gòu) 200層甚至更多層面的橫截面圖像, 確定復雜的內(nèi)部聯(lián)系, 因此目前我們做實驗時主要用于解釋其三維結(jié)構(gòu)與組織功能之間的關系。4 動態(tài)觀察生物結(jié)構(gòu)，長時間觀察細胞遷移和生長我們可以將激光掃描共聚焦顯微鏡設置成按定時和定方式兩種方式進行激光掃描，實驗時只需要很小的激光強度就可以完成傳統(tǒng)很大的激光照射量，減小了每次掃描時激光束對細胞的損傷。因此，由于每次損傷小，我們可以用LSCM

6、于長時程定時掃描，記錄細胞遷移等細胞生物學現(xiàn)象。傳統(tǒng)方法對活體組織進行成像非常困難, 成功的活細胞成像必須使細胞在成像過程里一直保持健康的生長狀態(tài), 而傳統(tǒng)方法較大的輻射量阻礙了細胞的成長。如果我們采用比較小的激光照射量（如LSCM）以減輕累積的光損傷，再加上在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑, 減少受激發(fā)的自由基帶來的傷害，就可以完成對活體細胞的成像。我們利用合適的熒光探針, LSCM 可對細胞內(nèi)各種生命代謝所必須的離子如 Ca2+, K +, Na +和 pH 等的動態(tài)變化作實時分析, 甚至我們可以用LSCM完成生理信號如膜電位等的動態(tài)監(jiān)測。例如，可以研究心肌細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放的機制。LSCM

7、在胚胎學研究中也有廣泛的應用。例如對卵子的活化和卵裂過程中的形態(tài)變化、對動物胚胎形成的形態(tài)學等進行研究。 5 熒光光漂白恢復( FRAP)技術若我們借助高強度激光照射細胞的某一區(qū)域, 該區(qū)域周圍的非淬滅（淬滅表明在熒光過程中，光子的數(shù)量在很短的時間內(nèi)衰減或者消失。）分子會以一定速率向該照射的區(qū)域進行擴散, 隨后我們只需通過低強度激光掃描對檢測此擴散速率，就可以由此揭示細胞結(jié)構(gòu)和各種變化的機制。所以目前LCSM可用于研究細胞骨架、核膜結(jié)構(gòu)和大分子傳輸?shù)?。在細胞生物學領域的主要應用有: 研究生物膜脂質(zhì)分子的擴散、通訊的研究；胞漿及細胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移的觀測等。6 質(zhì)膜流動性測定我們將偏振光線激發(fā)

8、細胞膜熒光探針后, 會發(fā)現(xiàn)其發(fā)射光偏振的程度和熒光分子種類有關, 而這種有序的運動又依賴于熒光分子周圍的膜流動性。 因此, 通過計算機軟件, LSCM 可對膜的流動性進行必要的數(shù)據(jù)分析。這種膜流動性在測定在膜組成的分析、研究藥物效應以及溫度反應測定等方面有重要作用。7 激光細胞顯微外科及光鉗技術LSCM 可作“ 光刀” 使用, 由于其精細程度很高，我們可以對細胞膜完成瞬間穿孔、線粒體等細胞器的瞬間燒灼，染色體切割等細胞水平上的外科手術。同時，光鉗技術, 是利用學效應, 用高能光束的力量將一個微米水平上的細胞器結(jié)構(gòu)限制于激光束的焦平面, 實現(xiàn)細胞微小顆粒和結(jié)構(gòu)的移動、細胞融合技術及細胞骨架的彈性

9、測量等，通過這種方法來無損傷地操縱生物粒子。LSCM 與光刀、光鉗的組合將有助于在分子水平, 細胞水平研究生物醫(yī)學: 如染色體微切割、特定活體細胞生理狀態(tài)檢測、免疫細胞作用方式等。8 光活化技術我們發(fā)現(xiàn)許多重要的生物活性物質(zhì)和一些化合物(如神經(jīng)遞質(zhì)、細胞內(nèi)第二信使、核苷酸、某些熒光素等)可構(gòu)成籠鎖，將其功能進行封閉; 一旦特定波長的光照射籠鎖，則因活化而瞬間解鎖， 原有活性和功能得以恢復，正是基于這種特性，我們用他們在細胞增殖、分化等代謝過程中發(fā)揮重要作用。LSCM 即具有光活化測定功能，可以產(chǎn)生使籠鎖分解的合適的光波長和照射時間, 從而人為控制多種生物活性產(chǎn)物，并控制其發(fā)揮作用的時間和空間。

10、在生物醫(yī)學上主要應用于: 肌肉生理, 如胞內(nèi) Ca2 +對心肌鈣電流的調(diào)控等; 鈣和膜電位對神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)作用; 鈣振蕩的機制; 微管動力學。展望激光掃描共聚焦顯微鏡是目前研究細胞水平上應用非常廣泛，同時分辨率很高的儀器，隨著科學技術的發(fā)展，激光掃描共聚焦顯微鏡會朝著更靈敏，微型和便于運用的目標發(fā)展，例如現(xiàn)在多家公司正在研制多光子 LSCM，多光子技術就是使一個熒光分子同時吸收兩個及以上光子的技術。由此就可以利用低能光子同時釋放能量來代替單個高能光子的作用。總體上來說，激光掃描共聚焦顯微技術的發(fā)展趨勢有兩大個，其一是從光學物理工作原理上進一步的革新，來提高其診斷和觀察效率，使之成為更長時間記錄的高分辨率顯微儀器；另一方面是與多光子技術相結(jié)合 ,提高激光束的穿透能力，降低光對細胞帶來的損傷。目前，多光子顯微技術仍處于萌芽發(fā)展階段，主要優(yōu)點是細胞光毒性較小，因而可延長觀察時間，同時穿透性較好，理論上的最大穿透深度可達 200 500m，能夠觀察更厚的標本 ，主要問題是分辨率比激光掃描共聚焦顯微鏡低，價格十分昂貴 。因此 , 在未來的幾年內(nèi)，高質(zhì)量的激光掃描共聚焦顯微鏡仍然是生物醫(yī)學研究中最有效和最