分子生物學(xué)2009-2010-10-研究方法-5-核酸雜交-分子雜交-SNP-芯片

1、郜剛分子生物學(xué)教案教學(xué)單元教案格式 2 第5章研究方法-5-核酸雜交-分子雜交-SNP-芯片 課程教案授課題目：第5章 研究方法-核酸雜交-分子雜交-SNP-芯片教學(xué)時(shí)數(shù)：1.5授課類(lèi)型： 理論課 實(shí)踐課教學(xué)目的、要求：理解：核酸雜交的原理 SNP的原理了解：生物芯片的類(lèi)型、基本制作、應(yīng)用等 教學(xué)重點(diǎn)：重點(diǎn)闡明：核酸雜交的類(lèi)型和原理重點(diǎn)指出：southern 、 northern 、western blotting的流程教學(xué)難點(diǎn)：絕對(duì)難點(diǎn)：三個(gè)印跡的操作過(guò)程相對(duì)難點(diǎn)：無(wú)教學(xué)方法和手段：老師講授為主：講授 視頻演示 PPT演示 討論。以電腦幻燈片邊演示邊講述為主，（白板課件）輔以板書(shū)（黑板板書(shū)）

2、學(xué)生回答問(wèn)題為輔：（如時(shí)間等條件許可的情況下）注：以下內(nèi)容按實(shí)際需要進(jìn)行取舍 要求有多媒體，因?yàn)樾畔⒘看?，許多結(jié)構(gòu)圖需要媒體放映，效果才好第15講：研究方法-5-核酸雜交-分子雜交-SNP-芯片 課程教案教學(xué)內(nèi)容及過(guò)程旁批教學(xué)內(nèi)容與教學(xué)設(shè)計(jì)：首先接上節(jié)課的尾巴：即各種基因文庫(kù)的篩選和鑒定，給學(xué)生指明四種不同的篩選方法，以及各方法的有效率，將教材上的先后順序進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，把核酸雜交放到最后講，這樣可以引入新的內(nèi)容，因?yàn)楹罄m(xù)的SNP和芯片等技術(shù)都要用到核酸雜交技術(shù)。這是相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的核心技術(shù)。然后進(jìn)入新的內(nèi)容，2.1遺傳物質(zhì)(之染色體與DNA)5.3.3 基因文庫(kù)的篩選1 表型篩選法(1)

3、 抗藥性篩選（插入失活篩選法）：這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法。通過(guò)在抗藥性標(biāo)記上插入外源片段引起該標(biāo)記所在基因的失活，然后在相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行抗藥性培養(yǎng)。(2) 顯色反應(yīng)選擇法(-互補(bǔ)法)將含有-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個(gè)氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細(xì)胞中，可使各自無(wú)活性的片段實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，融為一體，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(異丙基-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-D-硫代半乳糖苷)的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色菌落，這種現(xiàn)象就稱(chēng)為-互補(bǔ)。2 PC

4、R篩選法利用合適的引物，以從初選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中提出的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析，確定目的基因是否插入到載體中。3 免疫篩選法4 核酸雜交法將被篩選的大腸桿菌菌落，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中小心地轉(zhuǎn)移到鋪放在瓊脂平板表同的硝酸纖維素濾膜上，而后進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏赜?。取出已?jīng)長(zhǎng)有菌落的硝酸纖維素濾膜，使用堿液處理，使 DNA變性。然后再用適當(dāng)?shù)霓k法處理濾膜以除去蛋白質(zhì)，留下的便是同硝酸纖維素濾膜結(jié)合的變性DNA。變性DNA同硝酸纖維素濾膜有很強(qiáng)的親全力，這樣便形成了菌落的“DNA印跡”。在80下烘烤濾膜，以使DNA牢固地固定下來(lái)。將這些濾膜同放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，并通過(guò)放

5、射自顯影檢測(cè)雜交的結(jié)果。含有同探針互補(bǔ)的DNA的菌落，在X光底片上呈現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)（圖），通過(guò)同原培養(yǎng)基平板上菌落位置的對(duì)照，挑選出陽(yáng)性菌落，便是我們所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆。（1）原理帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)在退火時(shí)發(fā)生互補(bǔ)形成雙鏈的結(jié)構(gòu)（2）特點(diǎn)與DNA的來(lái)源（物種）無(wú)關(guān)在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 補(bǔ)充1： 分子雜交種類(lèi) 1. 按其分子種

6、類(lèi)劃分 1） DNA雜交探針為DNA或RNA 2） RNA雜交探針為DNA或cDNA3） 蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體補(bǔ)充2. 按樣品制備過(guò)程劃分 1） 原位雜交(in situ hybridization) i. 原位菌落雜交 ii. 原位噬菌斑雜交 iii. 原位細(xì)胞雜交 iv. 原位組織塊雜交 共同的特點(diǎn)：原位裂解細(xì)胞不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品可同時(shí)處理大量樣品常用于目的基因的篩選或檢測(cè)某類(lèi)細(xì)胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。2. 按樣品制備過(guò)程劃分2）斑點(diǎn)雜交(dot hybridization)【有視頻文件可看】 先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液

7、直接點(diǎn)在膜上，取出膜烤干或紫外線(xiàn)照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。不能測(cè)定分子量大小。 3）印跡雜交或轉(zhuǎn)移雜交 (blotting hybridization) 先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測(cè)出目標(biāo)分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有： i. 擴(kuò)散法 ii. 毛細(xì)管法 iii. 電泳轉(zhuǎn)移法 iv. 真空轉(zhuǎn)移法v. 電（場(chǎng)）轉(zhuǎn)移法 4) 夾心雜交法(sandwich hybridization) 它利用兩種探針與待測(cè)DNA結(jié)合，先將不帶標(biāo)記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測(cè)樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標(biāo)記的探針雜交。這種方法可

8、用于粗制DNA樣品，可檢測(cè)出0.2ng的DNA樣品補(bǔ)充3. 分子雜交的一般程序 1) DNA和RNA的雜交 制備DNA或RNA樣品與固定基質(zhì)結(jié)合80真空固定預(yù)雜交加入標(biāo)記探針雜交洗滌放射自顯影或顯色反應(yīng)。 2）蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定封閉劑封閉 一抗反應(yīng)洗滌二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)洗滌顯色反應(yīng)（EIA） 或 一抗放射標(biāo)記物洗滌放射自顯影（RIA）補(bǔ)充二. 雜交樣品所用的各種膜（的制備） 1. 固定基質(zhì)的種類(lèi)與特性 1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulose filter, NCF)可能是通過(guò)被動(dòng)吸附可與三類(lèi)較大分子的結(jié)合。NCF不能結(jié)合小分子DNA，RNA和

9、蛋白質(zhì)（20,000）優(yōu)點(diǎn)：1. 用于DNA，RNA雜交分析時(shí)結(jié)果可靠，靈敏，本底低。 2. 用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要預(yù)激活；易于操作缺點(diǎn)： 結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)使用探針次數(shù)有限（2-3次）2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙 優(yōu)點(diǎn)：是能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價(jià)結(jié)合，可用不同探針進(jìn)行多次雜交分析。 缺點(diǎn)：該類(lèi)基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時(shí)最好用放射性標(biāo)記物。這類(lèi)基質(zhì)對(duì)生物大分子是主動(dòng)吸附。3) 尼龍膜 i ) 陽(yáng)離子尼龍膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）優(yōu)點(diǎn)：容量大, 蛋白質(zhì)可結(jié)合48

10、0g/cm2 可結(jié)合不同大小的DNA，RNA和蛋白質(zhì)。 韌性好 可用于電轉(zhuǎn)移 可進(jìn)行反復(fù)多次雜交試驗(yàn)，重復(fù)利用 廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒 缺點(diǎn)：不能用于蛋白質(zhì)的直接染色。 ii. 尼龍66 廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時(shí)陽(yáng)離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時(shí)陰離子狀態(tài)，電轉(zhuǎn)移時(shí)要注意。 4）其他離子膜 1. DEAE-纖維素紙可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制備回收 2. CM-纖維素紙可用于堿性蛋白質(zhì)的結(jié)合補(bǔ)充三、雜交樣品向膜上轉(zhuǎn)移的方法1. 擴(kuò)散法（Difusion blotting method )2. 毛細(xì)管法 (Capillary blotting method ) 3

11、. 電轉(zhuǎn)移法 (electro blotting )4. 真空轉(zhuǎn)移法 (Vaccum bllotting ) 轉(zhuǎn)移速度與凝膠的速度和厚度成反比，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時(shí)，真空法比毛細(xì)管法快13倍，其損失僅6%，而毛細(xì)管法損失率20%。具體的雜交方法v 斑點(diǎn)印跡 (dot-blot)法v Southern印跡(Southern blot) v Northern印跡(Northern blot) v Western印跡(Western blot) v 免疫印跡(immunoblotting) v 其他斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)D

12、NA點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù) (DNA chip) SNP技術(shù)Southern Blot 將DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段； 經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定，凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。 附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。（二）RNA印跡技術(shù) Northern blotting 又稱(chēng)為Northern雜交，即RNA-DN

13、A雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。 主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。（三）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)Western blotting 又稱(chēng)為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。 應(yīng)用：用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。 Dot blotting斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而將被檢標(biāo)本直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定，用于雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。 原位雜交in

14、 situ hybridization即組織原位雜交，指組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。補(bǔ)充：探針技術(shù)探針的制備與應(yīng)用探針(probe)：分子雜交檢測(cè)其互補(bǔ)序列的標(biāo)記DNA或RNA序列，能在許多DNA或RNA序列的復(fù)雜混合物中識(shí)別所需克隆的分子。DNA探針(DNA probe)RNA探針(RNA probe)簡(jiǎn)并探針(degenerate probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在N

15、C膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。v 同位素標(biāo)記v 32P，35S，3Hv 非同位素標(biāo)記v 地高辛v 生物素分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白可結(jié)合4個(gè)生物素分子。還可以摻入到DNA核酸分子切口平移法利用DNA聚合酶的5-3外切酶活性和5-3聚合酶活性隨機(jī)引物延伸法末端標(biāo)記法i. 5-末端標(biāo)記 ss-和ds-DNA, RNA脫磷酸化反應(yīng) T4DNA激酶(-32P )ATPii. 3-末端標(biāo)記 i) TdT加尾反應(yīng)，用于dsDNA5.4 單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism

16、,SNP)5.4.1 定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。不同個(gè)體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。 1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性 標(biāo)記（single nucleotid polymorphism SNP） 制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。5.4.2 SNP 的特征 是單個(gè)核苷酸變化引起的 在基因組中分布廣泛 分布位置隨機(jī) 基因編碼區(qū)SNP，cSNP 基因調(diào)控區(qū)SNP，pSNP 隨機(jī)非編碼區(qū)SNP，rSNP 多個(gè)相關(guān)聯(lián)的SNP組成一個(gè)單倍型5.4.3 SNP檢測(cè)方法1、基因芯片技術(shù)（本質(zhì)上是利用嚴(yán)格的核酸雜交來(lái)排

17、除具有SNP的序列，后者不能雜交）：2、Taqman技術(shù)（本質(zhì)同上）；3、分子信標(biāo)技術(shù)（本質(zhì)同上）；4、焦磷酸測(cè)序法（以后再講）但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測(cè)。補(bǔ)充資料生物芯片生物芯片是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是指利用機(jī)器人進(jìn)行操作，通過(guò)縮微技術(shù)、微加工技術(shù)、光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)和微電子技術(shù)等，自動(dòng)在硅片、玻璃片、凝膠或尼龍膜等物質(zhì)制造的固體芯片表面上，將成千上萬(wàn)的具有生物活性的大分子（DNA等）制作成微陣列。生物芯片的一般類(lèi)型 1. 按照芯片基質(zhì)上固定的生物材料的不同，可以將生物芯片劃分為DNA或基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、RNA芯片、

18、細(xì)胞芯片、組織芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on chip)。如果芯片上固定的是肽或蛋白，則稱(chēng)為肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探針或DNA，就是DNA芯片。“芯片實(shí)驗(yàn)室”通過(guò)微細(xì)加工工藝制作的微濾器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門(mén)、微電極等以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品從制備、生化反應(yīng)到檢測(cè)和分析的全過(guò)程，從而極大地縮短的檢測(cè)和分析時(shí)間，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)材料，相當(dāng)于一個(gè)具有各種功能的芯片的集合體。2. 按照生物芯片的制作技術(shù)，可以將生物芯片劃分為微矩陣和原位合成芯片。3. 根據(jù)生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，又可以將生物芯片進(jìn)行另外一種分類(lèi)：因?yàn)橥ǔ５纳锘瘜W(xué)反應(yīng)過(guò)程包括三步：即樣品的制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測(cè)和分析。所以

19、我們可以根據(jù)這三個(gè)不同的步驟，把生物芯片分為不同的類(lèi)型即用于樣品制備的生物芯片，生化反應(yīng)生物芯片及各種檢測(cè)用生物芯片等。4. 根據(jù)原理還有元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片?；蛐酒蛐酒褪敲撗鹾颂呛怂岬奈Ⅻc(diǎn)陣，在極小的芯片上，成一定規(guī)則地排列著大量已知堿基序列的DNA片段。將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，去辨識(shí)被檢測(cè)的未知序列的DNA，從而確定對(duì)方的身份?；蛐酒笇?duì)數(shù)以千記的DNA片段同時(shí)進(jìn)行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達(dá)譜

20、的檢測(cè)等（Trends in Biotechnology)這里有一點(diǎn)需要說(shuō)明的是由于基因芯片（Genechip）這一專(zhuān)有名詞已經(jīng)被業(yè)界的這個(gè)龍頭老大Affymetrix公司注冊(cè)專(zhuān)利，因而其他廠(chǎng)家的同類(lèi)產(chǎn)品通常稱(chēng)為DNA微陣列（DNA Microarray）。相應(yīng)的這項(xiàng)技術(shù)也被稱(chēng)為DNA微陣列技術(shù)。 基因芯片技術(shù)的主要特點(diǎn) 技術(shù)操作簡(jiǎn)單 自動(dòng)化程高 序列數(shù)量大 檢測(cè)效率高 應(yīng)用范圍廣 成本? 按照基因芯片的用途可分為表達(dá)譜芯片（如用于基因功能研究） 、診斷芯片（如用于肝癌、糖尿病等疾病的基因診斷的診斷芯片） 、指紋圖譜芯片、測(cè)序芯片、毒理芯片（如用于商品檢疫芯片）等等。如果按照芯片基質(zhì)的不同可以分為無(wú)機(jī)片基芯片（半導(dǎo)體硅片和玻璃片，其上的探針主要以原位聚合的方法合成）和有機(jī)合成物片基芯片（主要有特定孔徑硝酸纖維膜、聚丙烯膜和尼龍膜，其上的探針主要是預(yù)先合成后通過(guò)特殊的微量點(diǎn)樣裝置或儀器滴加到片基上去）。如果按照芯片基質(zhì)的不同可以分為無(wú)機(jī)片基芯片（半導(dǎo)體硅片和玻璃片，其上的探針主要以原位聚合的方法合成）和有機(jī)合成物片基芯片（主要有特定孔徑硝酸纖維膜、聚丙烯膜和尼龍膜，其上的探針主要是預(yù)先合成后通過(guò)特殊的微量點(diǎn)樣裝置或儀器滴加到片基上去）。而按照