基因治療的策略

1、基因治療的策略？答：1、基因置換或稱基因矯正：特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募毎?，通過定位重組，讓導入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。2.基因添加：通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。3.基因干預：采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結(jié)構而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。4.自殺基因治療：將“自殺”基因?qū)胨拗骷毎校@種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應。PCR的基本原理？答：PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理是依據(jù)細胞內(nèi)DNA半保留復制的機理，以及體外DNA分子于不同溫度下

2、雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復進行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸個步驟構成PCR反應的一個循環(huán)，此循環(huán)的反復進行，就可使目的DNA得以迅速擴增。DNA模板變性：模板雙鏈DNA?單鏈DNA，94。退火：引物單鏈DNA?雜交鏈，引物的Tm值。引物的延伸：溫度至70 左右， Taq DNA聚合酶以種dNTP為原料，

3、以目的DNA為模板，催化以引物末端為起點的53DNA鏈延伸反應，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應的模板PCR，就是如此反復循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴增。本章的主要內(nèi)容： 基因表達調(diào)控的基本概念、特點、基本原理。乳糖操縱子的結(jié)構、負性調(diào)控、正性調(diào)控、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄衰減、SOS反應。真核基因及基因表達調(diào)控的特點、順式作用元件和反式作用因子的概念、種類和特點. 以及它們在轉(zhuǎn)錄激活中的作用。 本章的要點： 第一節(jié) 基因表達調(diào)控基本概念與原理 一、 基因表達的概念 基因是一段DNA分子，編碼一種多肽鏈或 RNA。基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生具有一定功能的蛋白質(zhì)的過程。

4、大多數(shù)基因的表達產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，部分基因如rRNA和tRNA 基因的表達產(chǎn)物是RNA. 二、基因表達的特點 （A）時間特異性或發(fā)育階段特異性、（B）空間特異性或組織細胞特異性，（C）有兩種表達方式，管家基因幾乎在所有的細胞和所有的發(fā)育階段持續(xù)表達，基本不受環(huán)境因素的影響，只受啟動子調(diào)節(jié)。另外一些基因的表達受環(huán)境因素的誘導或阻遏。（D）基因表達可在多層次上受到調(diào)節(jié)如基因、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工 翻譯和翻譯后加工等水平上進行調(diào)節(jié)。但最主要的是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，本章討論的內(nèi)容是原核基因和真核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。 三、基因轉(zhuǎn)錄激活的基本要素（A）特異的調(diào)節(jié)序列 是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的片段,如原核生物操縱子調(diào)控區(qū)中的啟

5、動序列、操縱序列、P蛋白結(jié)合位點和真核基因的啟動子、增強子和沉默子等。（B）調(diào)節(jié)蛋白 是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和蛋白、真核生物的基本轉(zhuǎn)錄因子和特異轉(zhuǎn)錄因子等。（C）聚合酶 是催化基因轉(zhuǎn)錄最主要的酶。原核生物只有一種聚合酶，催化所有的轉(zhuǎn)錄。真核生物有三種聚合酶，催化不同的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)元件和調(diào)節(jié)蛋白可以通過影響RNA聚合酶的活性來調(diào)接基因轉(zhuǎn)錄激活。 第二節(jié) 原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 一 原核基因表達調(diào)節(jié)的特點：（A）因子決定聚合酶識別特異性，幫助聚合酶識別不同啟動子，對不同基因進行轉(zhuǎn)錄。（B）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)普遍采用操縱子模式, 原核生物功能相關的基因往往串聯(lián)地排列在一起，在一個共同的調(diào)控區(qū)的

6、調(diào)節(jié)下，一起轉(zhuǎn)錄生成一個多順反子，最終表達產(chǎn)物是一些功能相關的酶或蛋白質(zhì)，它們起參與某種底物的代謝或某種產(chǎn)物的合成。（C）阻遏蛋白對轉(zhuǎn)錄的抑制作用是普遍存在的貢性調(diào)節(jié)。 二、乳糖操縱子的結(jié)構、負性和正性調(diào)節(jié)及協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) （A）乳糖操縱子包括三個結(jié)構基因（Z、 Y、 A）三個調(diào)節(jié)序列：啟動序列、操縱序列和CAP蛋白結(jié)合位點，以及一個調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)基因編碼阻遏蛋白。（B）、阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié) 蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合抑制基因的轉(zhuǎn)錄屬于負性調(diào)節(jié)。操縱序列是控制操縱子中結(jié)構基因轉(zhuǎn)錄的開關,阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合可阻止RNA聚合酶對結(jié)構基因的轉(zhuǎn)錄。當乳糖存在時，乳糖的分鮮產(chǎn)物半乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，導致阻遏蛋白與

7、操縱序列解離，誘導基因的轉(zhuǎn)錄。（C） CAP的正性調(diào)節(jié) 蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合增強基因轉(zhuǎn)錄屬于正性調(diào)節(jié)。在啟動子上游子存在CAP結(jié)合位點, CAP與其結(jié)合后可促進RNA聚合酶與啟動秀列結(jié)合，從而促進轉(zhuǎn)錄。但是,CAP單獨不能與其位點結(jié)合，只有與cAMP形成復合物后才能與CAP位點結(jié)合。細胞內(nèi)葡萄糖缺乏時，cAMP水平升高，cAMP一CAP復合物形成并與CAP結(jié)合位點結(jié)合，促進RNA聚合酶與啟動序列結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄。葡萄糖豐富時，cAMP水平降低，cAMP一CAP復合物不能形成，P不能與DNA結(jié)合，不能啟動轉(zhuǎn)錄。（D）、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié) 即阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)與蛋白正性調(diào)節(jié)的協(xié)同作用。當阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合封

8、閉轉(zhuǎn)錄后，不能啟動轉(zhuǎn)錄，但是阻遏蛋白脫離操縱序列而解除封閉后，如果沒有的作用也不能啟動轉(zhuǎn)錄，所以乳糖操子的誘導作用即需要乳糖的存在又需要葡萄糖的缺乏。 三、 操縱子的其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制 （A）轉(zhuǎn)錄衰減作用 最早在阻遏型的色氨酸操縱子發(fā)現(xiàn)，當色氨酸豐富時，核蛋白體迅速通過前導編碼序列！使后面的序列形成衰減子，導致聚合酶的脫落和轉(zhuǎn)錄終止。轉(zhuǎn)錄衰減實質(zhì)上是轉(zhuǎn)錄和前導肽翻譯過程的偶聯(lián)，是原核生物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制。（B）0反應 是大腸桿菌特有的一種損傷修復機制 . 參與損傷修復的一些0基因受一個共同的L阻遏蛋白的控制，正常情況下L與結(jié)合阻止了這些基因的表達，當紫外線照射造成損傷時，蛋白產(chǎn)生蛋白水解酶活性

9、，使L蛋白水解失活，導致0基因轉(zhuǎn)錄表達，并對損傷的進行 修復 第三節(jié) 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 真核基因數(shù)量多，基因表達調(diào)節(jié)機制復雜，基因表達可在、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯和翻譯后加工等水平上調(diào)節(jié)，但最主要的是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。 、 真核基因組結(jié)構特點 （A） 真核基因組結(jié)構龐大，由30億堿基對組成，有4萬多個基因。（B）單順反子 真核細胞一般以一個基因為轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是單順反子、即編碼一種多肽的。（C）重復序列 真核基因組中編碼序列只占5一10%，其余8090% 是非編碼序列，其中有大量的重復序列。重復序列長短不同,重復率不等，而且具有種屬特異性。（D）基因不連續(xù)性 真核基因的編碼序列不連續(xù)

10、排列，被一些非編碼序列間隔開，編碼序列稱外顯子，非編碼序列稱內(nèi)含子。 二、真核基因表達調(diào)節(jié)特點 （A）RNA聚合酶 原核生物只有一種RNA 聚合酶，真核生物有三種，分別轉(zhuǎn)錄不同的RNA，RNA聚合酶II負責轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)的基因 ，因此該酶最為重要 。（B）活性染色質(zhì)結(jié)構的變化 基因轉(zhuǎn)錄可在染色質(zhì)水平上調(diào)節(jié)，基因轉(zhuǎn)錄激活的染色質(zhì)在結(jié)構和性質(zhì)上發(fā)生如下變化；（1） 由于轉(zhuǎn)錄激活區(qū)組蛋白部分脫落，產(chǎn)生DNase I超敏位點 。（2）DNA 拓撲構像發(fā)生變化，DNA轉(zhuǎn)錄時，RNA 聚合酶的前面是正超螺旋，后面是負螺旋。（3）DNA堿基修飾變化 轉(zhuǎn)錄激活的基因處于低甲基化狀態(tài)。（4）組蛋白的數(shù)量、結(jié)構和化學

11、修飾發(fā)生變化 （C）正性調(diào)節(jié)占主導地位 蛋白質(zhì)與 DNA結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄是負性調(diào)節(jié)， 蛋白質(zhì)與 DNA結(jié)合后促進基因轉(zhuǎn)錄是正性調(diào)節(jié)。 在原核生物中阻遏蛋白與 DNA結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄是負性調(diào)節(jié)。在真核生物中有許多轉(zhuǎn)錄激活因子，它們與增強子DNA結(jié)合促進轉(zhuǎn)錄屬于正性調(diào)節(jié)。 三、真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié) 真核基因轉(zhuǎn)錄激活也需要DNA調(diào)節(jié)序列 調(diào)節(jié)蛋白和RNA聚合酶三大要素。（A）順式作用元件 真核生物的DNA調(diào)控元件稱為順式作用元件， 包括啟動子，增強子和沉默子。它們通過DNA和蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用，最終改變RNA聚合酶的活性而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。典型的啟動子由TATA盒及其上游的GC盒和CAAT盒組成 。增

12、強子是遠離啟動子的、可促進轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，其作用與方向和位置無關，而且具有組織特異性。它一般與轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，通過作用于轉(zhuǎn)錄起始復合物增強RNA聚合酶的活性 ，從而促進轉(zhuǎn)錄。沉默子是一種負性調(diào)控元件，它與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄。（B）反式作用因子 是影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白，包括基本轉(zhuǎn)錄因子和特異轉(zhuǎn)錄因子，基本轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶構成轉(zhuǎn)錄起始復合物，有人將它們稱為RNA聚合酶的亞基， 它們在所有的細胞中都存在 ，對于三種RNA聚合酶，除個別基本轉(zhuǎn)錄因子都是通用的。特異轉(zhuǎn)錄錄因子包括轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子，前者與增強子結(jié)合增強基因轉(zhuǎn)錄，后者與沉默子結(jié)合抑制基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子一般含有DNA

13、結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域，前者是轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的位點，如鋅指結(jié)構和堿性氨基酸組成的螺旋. 后者是轉(zhuǎn)錄因子與轉(zhuǎn)錄起始復合物中某種蛋白質(zhì)相互作用的位點，此外，某些轉(zhuǎn)錄因子還有蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互的結(jié)構域 （三）mRNA基因轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié) mRNA基因是蛋白質(zhì)基因，在基因組中占據(jù)絕大多數(shù)，由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，真核RNA聚合酶II與十幾種基本轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成轉(zhuǎn)錄起始復合物，對蛋白質(zhì)基因進行轉(zhuǎn)錄?；巨D(zhuǎn)錄因子中只有TFII D可以和TATA盒結(jié)合. TFII D由TBP（TATA結(jié)合蛋白）和十幾種TBP相關因子（TAF）構成。真核基因調(diào)節(jié)的三大要素是順式作用元件 反式作用因子和RNA聚合酶，它們通過D

14、NA和蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄。例如一種轉(zhuǎn)錄激活因子和某種增強子結(jié)合，通過作用于轉(zhuǎn)錄起始復合物中的某種蛋白質(zhì)引起RNA聚合酶的構想改變或化學修飾，最終導致其活性增加，從而激活轉(zhuǎn)錄。雖然增強子距離啟動子和RNA聚合酶很遠，但是DNA可以彎曲，使轉(zhuǎn)錄激活因子與啟動子上的轉(zhuǎn)錄起始復合物靠近，與復合物中的某種蛋白質(zhì)（TBP或 TAF）相互作用，然后通過它作用于RNA聚合酶，從而激活轉(zhuǎn)錄。 基因表達調(diào)控考點：基因表達調(diào)控的基本概念、特點、基本原理；原核生物乳糖操縱子的結(jié)構、負性調(diào)控、正性調(diào)控、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄衰減、 SOS反應；真核生物基因表達調(diào)控的特點、順式作用元件和反式作用因子的概念

15、、種類和特點，以及它們在轉(zhuǎn)錄激活中的作用。重點：基因表達調(diào)控的基本概念，原核、真核生物基因表達調(diào)控的特點，順式作用元件和反式作用因子。難點：原核、真核生物基因表達調(diào)控的特點及機制。一、概述（一）基因表達的概念一個細胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因，稱為基因組?；虮磉_就是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程。在一定調(diào)節(jié)機制控制下，大多數(shù)基因經(jīng)歷基因激活、轉(zhuǎn)錄及翻譯等過程，產(chǎn)生具有特異生物學功能的蛋白質(zhì)分子，但并非所有基因表達過程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)， tRNA、rRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄合成RNA的過程也屬于基因表達。（二）基因表達的時間性及空間性基因表達的時間、空間特異性由特異基因的啟動子（序列）和（或）性強子與調(diào)

16、節(jié)蛋白相互作用決定。1時間特異性按功能需要，某一特定基因的表達嚴格按特定的時間順序發(fā)生，這是基因表達的時間特異性。 多細胞生物基因表達的時間特異性又稱階段特異性。2空間特異性在個體生長全過程，某種基因產(chǎn)物在個體按不同組織空間順序出現(xiàn)，這就是基因表達的空間特異性。又稱細胞特異性或組織特異性。（三）基因表達的方式1組成性表達某些基因產(chǎn)物對生命全過程是必需的或必不可少的。這類基因在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因。管家基因較少受環(huán)境因素影響，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。這類基因表達視為基本的或組成性基因表達。2誘導和阻遏表達與管家基因不

17、同，另有一些基因表達極易受環(huán)境變化影響。在特定環(huán)境信號刺激下，相應的基因被激活，基因表達產(chǎn)物增加，這種基因是可誘導的，稱為誘導。相反，如果基因?qū)Νh(huán)境信號應答時被抑制，基因表達產(chǎn)物水平降低的，稱為阻遏。 誘導和阻遏是同一事物的兩種表現(xiàn)形式，在生物界普遍存在，也是生物體適應環(huán)境的基本途徑。在一定機制控制下，功能上相關的一組基因，無論其為何種表達方式，均需協(xié)調(diào)一致、共同表達，即為協(xié)調(diào)表達。這種調(diào)節(jié)稱為協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。（四）基因表達調(diào)控的生物學意義1適應環(huán)境、維持生長和增殖。2維持個體發(fā)育與分化。二、基因表達調(diào)控的基本原理（一）基因表達的多級調(diào)控基因的結(jié)構活化、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運、mRNA降解、翻譯

18、及翻譯后加工及蛋白質(zhì)降解等均為基因表達調(diào)控的控制點?？梢姡虮磉_調(diào)控是在多級水平上進行的復雜事件。其中轉(zhuǎn)錄起始是基因表達的基本控制點。四個基本的調(diào)控點：（1）基因結(jié)構的活化。DNA暴露堿基后RNA聚合酶才能有效結(jié)合?；罨癄顟B(tài)的基因表現(xiàn)為：1.對核酸酶敏感；2.結(jié)合有非組蛋白及修飾的組蛋白；3.低甲基化。（2）轉(zhuǎn)錄起始。最有效的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，通過DNA元件與調(diào)控蛋白相互作用來調(diào)控基因表達。（3）轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運。RNA編輯、剪接、轉(zhuǎn)運。（4）翻譯及翻譯后加工。翻譯水平可通過特異的蛋白因子阻斷mRNA翻譯翻譯后對蛋白的加工、修飾也是基本調(diào)控環(huán)節(jié)。（二）基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素1DNA序列原核生物大多

19、數(shù)基因表達調(diào)控是通過操縱子機制實現(xiàn)的。操縱子通常由 2個以上的編碼序列與啟動序列、操縱序列以及其他調(diào)節(jié)序列在基因組中成簇串聯(lián)組成。啟動序列是RNA聚合酶結(jié)合并起動轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。多種原核基因啟動序列特定區(qū)域內(nèi)，通常在轉(zhuǎn)錄起始點上游-10及-35區(qū)域存在一些相似序列，稱為共有序列。大腸桿菌及一些細菌啟動序列的共有序列在-10區(qū)域是TATAAT，又稱Pribnow盒（PribnowBox），在-35區(qū)域為 TTGACA。這些共有序列中的任一堿基突變或變異都會影響RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始。因此，共有序列決定啟動序列的轉(zhuǎn)錄活性大小。操縱序列是原核阻遏蛋白的結(jié)合位點。當操縱序列結(jié)合阻

20、遏蛋白時會阻礙RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，或使RNA聚合酶不能沿DNA向前移動，阻遏轉(zhuǎn)錄，介導負性調(diào)節(jié)。原核操縱子調(diào)節(jié)序列中還有一種特異DNA序列可結(jié)合激活蛋白，使轉(zhuǎn)錄激活，介導正性調(diào)節(jié)。順式作用元件就是指可影響自身基因表達活性的 DNA序列。在不同真核基因的順式作用元件中會時常發(fā)現(xiàn)一些共有序列，如 TATA盒、CCAAT盒等。這些共有序列就是順式作用元件的核心序列，它們是真核RNA聚合酶或特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。順式作用元件通常是非編碼序列。順式作用元件并非都位于轉(zhuǎn)錄起點上游（5端）。根據(jù)順式作用元件在基因中的位置、轉(zhuǎn)錄激活作用的性質(zhì)及發(fā)揮作用的方式，可將真核基因的這些功能元件分為啟動子、

21、增強子及沉默子等。2調(diào)節(jié)蛋白原核調(diào)節(jié)蛋白分為三類：特異因子、阻遏蛋白和激活蛋白。特異因子決定RNA聚合酶對一個或一套啟動序列的特異性識別和結(jié)合能力。阻遏蛋白可結(jié)合操縱序列，阻遏基因轉(zhuǎn)錄。激活蛋白可結(jié)合啟動序列鄰近的DNA序列，促進RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，增強RNA聚合酶活性。真核調(diào)節(jié)蛋白又稱轉(zhuǎn)錄因子。絕大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達后，通過與特異的順式作用元件相互作用（DNA-蛋白質(zhì)相互作用）反式激活另一基因的轉(zhuǎn)錄，故稱反式作用因子。有些基因產(chǎn)物可特異識別、結(jié)合自身基因的調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)自身基因的開啟或關閉，這就是順式作用。具有這種調(diào)節(jié)方式的調(diào)節(jié)蛋白稱為順式作用蛋白。3DNA-蛋白質(zhì)

22、、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用DNA-蛋白質(zhì)相互作用指反式作用因子與順式作用元件之間的特異識別及結(jié)合。這種結(jié)合通常是非共價結(jié)合。絕大多數(shù)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合 DNA前需通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體或多聚體。所謂二聚化就是指兩分子單體通過一定的結(jié)構域結(jié)合成二聚體，它是調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合DNA時最常見的形式。由同種分子形成的二聚體稱同二聚體，異種分子間形成的二聚體稱異二聚體。除二聚化或多聚化反應，還有一些調(diào)節(jié)蛋白不能直接結(jié)合DNA，而是通過蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用間接結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。4RNA聚合酶DNA元件與調(diào)節(jié)蛋白對轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)最終是由RNA聚合酶活性體現(xiàn)的。啟動序列啟動子的結(jié)構，調(diào)節(jié)蛋白性質(zhì)對R

23、NA聚合酶活性影響很大。(1)啟動序列或啟動子與RNA聚合酶活性：原核啟動序列或真核啟動子是由轉(zhuǎn)錄起始點、RNA聚合酶結(jié)合位點及控制轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)組件組成。會影響其與RNA聚合酶的親和力，而親和力大小則直接影響轉(zhuǎn)錄起始頻率。（2）調(diào)節(jié)蛋白與RNA聚合酶活性：一些特異調(diào)節(jié)蛋白在適當環(huán)境信號刺激下在細胞內(nèi)表達，隨后這些調(diào)節(jié)蛋白通過DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用影響RNA聚合酶活性，從而使基礎轉(zhuǎn)錄頻率發(fā)生改變，出現(xiàn)表達水平變化。三、原核基因表達調(diào)控（一）原核基因調(diào)節(jié)特點1因子決定mRNA識別特異性 原核生物細胞僅含有一種RNA聚合酶，核心酶參與轉(zhuǎn)錄延長，全酶司轉(zhuǎn)錄起始。在轉(zhuǎn)錄起始階段，亞

24、基（又稱因子）識別特異啟動序列；不同的因子決定特異基因的轉(zhuǎn)錄激活，決定tRNA、mRNA和rRNA基因的轉(zhuǎn)錄。2操縱子模型的普遍性3阻遏蛋白與阻遏機制的普遍性（二）乳糖操縱子調(diào)節(jié)機制1乳糖操縱子的結(jié)構大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結(jié)構基因，分別編碼-半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調(diào)節(jié)基因?；蚓幋a一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點，由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點共同構成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表

25、達。2阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)在沒有乳糖存在時，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)。此時，基因列在P啟動序列操縱下表達的乳糖阻遏蛋白與O序列結(jié)合，故阻斷轉(zhuǎn)錄啟動。阻遏蛋白的阻遏作用并非絕對，偶有阻遏蛋白與O序列解聚。因此，每個細胞中可能會有寥寥數(shù)分子半乳糖苷酶、透酶生成。當有乳糖存在時，乳糖操縱子即可被誘導。真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖經(jīng)透酶催化、轉(zhuǎn)運進入細胞，再經(jīng)原先存在于細胞中的少數(shù) -半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖。后者作為一種誘導劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構型變化，導致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，使-半乳糖苷酶分子增加 1000倍。3CAP的正性調(diào)節(jié)分解代謝物基因激活蛋白 CAP是同二聚體，在其分子

26、內(nèi)有DNA結(jié)合區(qū)及cAMP結(jié)合位點。當沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時，cAMP與CAP結(jié)合，這時CAP結(jié)合在乳糖啟動序列附近的CAP位點，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性，使之提高50倍；當葡萄糖存在時，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達下降。由此可見，對乳糖操縱子來說 CAP是正性調(diào)節(jié)因素，乳糖阻遏蛋白是負性調(diào)節(jié)因素。兩種調(diào)節(jié)機制根據(jù)存在的碳源性質(zhì)及水平協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)乳糖操縱子的表達。4對調(diào)節(jié)機制的解釋大腸桿菌根據(jù)碳源性質(zhì)選擇代謝方式。倘若有葡萄糖存在時，細菌優(yōu)先選擇葡萄糖供應能量。葡萄糖通過降低 cAMP濃度，阻礙cAMP與CAP結(jié)合而抑制乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄，使細菌只能利用葡萄糖。在

27、沒有葡萄糖而只有乳糖的條件下，阻遏蛋白與 O序列解聚，CAP結(jié)合cAMP后與乳糖操縱子的CAP位點，激活轉(zhuǎn)錄，使得細菌利用乳糖作為能量來源。四、真核基因表達調(diào)控（一）真核基因組結(jié)構特點1真核基因組結(jié)構龐大哺乳類動物基因組DNA長達310 9個bp。2單順反子真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，即一個編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個 mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈。3重復序列在原核、真核DNA中都有重復出現(xiàn)的核苷酸序列，但在真核更普遍。根據(jù)重復頻率可將重復序列區(qū)分為高度重復序列（10 6次)、中度重復序列（10 310 4)及單拷貝序列。單拷貝序列在整個基因組中只出現(xiàn)一次或很少的幾次。4基因不連續(xù)性真核結(jié)構基因

28、兩側(cè)存在不被轉(zhuǎn)錄的非編碼序列，往往是基因表達的調(diào)控區(qū)。在編碼基因內(nèi)部尚有一些不為蛋白質(zhì)所編碼的間隔序列，稱內(nèi)含子，而編碼序列稱為外顯子，因此真核基因是不連續(xù)的。（二）真核基因表達調(diào)控特點1RNA聚合酶真核RNA聚合酶有三種，即RNA pol、，分別負責三種RNA轉(zhuǎn)錄。TATA盒結(jié)合蛋白為三種聚合酶所共有。2活性染色體結(jié)構變化（1）對核酸酶敏感。 （2）DNA拓撲結(jié)構變化。 天然狀態(tài)的雙鏈DNA以負性超螺旋的構象存在。當基因活化時，RNA聚合酶前方的轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA拓撲結(jié)構為正性超螺旋，后面的DNA則為負超螺旋，正性超螺旋不僅阻礙核小體結(jié)構形成，而且促進組蛋白 H 2AH 2B二聚體的釋放，有利轉(zhuǎn)錄

29、。（3）DNA堿基修飾變化。 在真核DNA有約5的胞嘧啶被甲基化為5甲基胞嘧啶，甲基化范圍與基因表達程度是反比關系。處于轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)的基因CpG序列一般是低甲基化的。（4）組蛋白變化。 H 1樣組蛋白減少。H 2AH 2B二聚體不穩(wěn)定性增加。組蛋白修飾：最常見的修飾有乙酰化、泛素化，修飾后使核小體結(jié)構變得不穩(wěn)定。H3組蛋白巰基暴露。3正性調(diào)節(jié)占主導提高了蛋白 -DNA相互作用的指導性，經(jīng)濟有效。4轉(zhuǎn)錄與翻譯間隔進行真核細胞有細胞核及胞漿等區(qū)間分布，轉(zhuǎn)錄與翻譯在不同亞細胞結(jié)構中進行。5轉(zhuǎn)錄后修飾、加工（三）真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)1順式作用元件順式作用元件是特異轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，按功能特性，真核基

30、因順式作用元件分為啟動子、增強子及沉默子。（1）啟動子。真核基因啟動子是 RNA聚合酶結(jié)合位點周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，每一組件含720bp的DNA序列。啟動子包括至少一個轉(zhuǎn)錄起始點，以及一個以上的功能組件。在這些功能組件中最具典型意義的就是TATA盒，TATA盒通常位于轉(zhuǎn)錄起始點上游-25至30bp，控制轉(zhuǎn)錄起始的準確性及頻率。典型的啟動子由TATA盒及上游的CCAAT盒和（或）GC盒組成，這類啟動于通常具有一個轉(zhuǎn)錄起始點及較高的轉(zhuǎn)錄活性。然而，還有很多啟動子并不含TATA盒，這類啟動子分為兩類：一類為富含GC的啟動子，最初發(fā)現(xiàn)于一類管家基因，這類啟動于包括一個或數(shù)個分離的轉(zhuǎn)錄起始點；另一類啟

31、動子既不含TATA盒，也沒有GC富含區(qū)，這類啟動子可有一個或多個轉(zhuǎn)錄起始點，但多數(shù)轉(zhuǎn)錄活性很低或根本沒有轉(zhuǎn)錄活性，而是在胚胎發(fā)育、組織分化或再生過程中受調(diào)節(jié)。（2）增強子。所謂強子就是遠離轉(zhuǎn)錄起始點、決定基因的時間、空間特異性表達、增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，其發(fā)揮作用的方式通常與方向、距離無關，可位于轉(zhuǎn)錄起始點的上游或下游。從功能上講，沒有增強子存在，啟動子通常不能表現(xiàn)活性；沒有啟動子時，增強子也無法發(fā)揮作用。（3）沉默子。某些基因含有負性調(diào)節(jié)元件沉默子，當其結(jié)合特異蛋白因子時，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（1）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子分類。轉(zhuǎn)錄因子，分為兩類：基本轉(zhuǎn)錄因子是RNA聚合酶結(jié)合

32、啟動子所必需的一組因子，為所有mRNA轉(zhuǎn)錄起動共有特異轉(zhuǎn)錄因子為個別基因轉(zhuǎn)錄所必需，決定該基因的時間、空間特異性表達，包括轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子。（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構。所有轉(zhuǎn)錄因子至少包括兩個結(jié)構域：DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域；此外，很多轉(zhuǎn)錄因子還包含一個介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構域，最常見的是二聚化結(jié)構域。DNA結(jié)合域通常由60100個氨基酸殘基組成。最常見的DNA結(jié)合域結(jié)構形式是鋅指結(jié)構和堿性螺旋。類似的堿性DNA結(jié)合域多見于堿性亮氨酸拉鏈和堿性螺旋-環(huán)-螺旋。轉(zhuǎn)錄激活域由30-100個氨基酸殘基組成。根據(jù)氨基酸組成特點，轉(zhuǎn)錄激活域又有酸性激活域、谷氨酰胺富含區(qū)域及脯氨酸富含區(qū)域。介

33、導二聚化的結(jié)構域二聚化作用與亮氨酸拉鏈、螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構有關。3mRMA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)真核 RNA 聚合酶不能單獨識別、結(jié)合啟動子，而是先由基本轉(zhuǎn)錄因子 TF D 組成成分 TBP 識別 TATA 盒或啟動元件，并有 TF A 參與結(jié)合，形成 TF D- 啟動子復合物；繼而在 TG AF 等參與下， RNA 聚合酶與 TF D 、 TF B 聚合，形成一個功能性的前起始復合物。在幾種基本轉(zhuǎn)錄因子中， TF D 是唯一具有位點特異的 DNA 結(jié)合能力的轉(zhuǎn)錄因子，在上述有序的組裝過程起關鍵性指導作用。這樣形成的前起始復合物尚不穩(wěn)定，也不能有效啟動 mRMA 轉(zhuǎn)錄。然后由結(jié)合在增強子上的轉(zhuǎn)錄激活

34、因子直接或間接與 TF D 結(jié)合，從而影響前起始復合物的形成、穩(wěn)定性以及 RNA 聚合酶的活性?；蛟\斷與基因治療基因診斷與基因治療能夠在比較短的時間從理論設想變?yōu)楝F(xiàn)實，主要是由于分子生物學的理論及技術方法，特別是重組DNA技術的迅速發(fā)展，使人們可以在實驗室構建各種載體、克隆及分析目標基因。所以對疾病能夠深入至分子水平的研究，并已取得了重大的進展。因此在20世紀70年代末誕生了基因診斷(gene diagnosis)；隨后于1990年美國實施了第一個基因治療(gene therapy)的臨床試驗方案。可見，基因診斷和基因治療是現(xiàn)代分子生物學的理論和技術與醫(yī)學相結(jié)合的范例。 基因診斷 o 基因診

35、斷的含義 傳統(tǒng)對疾病的診斷主要是以疾病的表型改變?yōu)橐罁?jù)，如患者的癥狀、血尿各項指標的變化，或物理檢查的異常結(jié)果，然而表型的改變在許多情況下不是特異的，而且是在疾病發(fā)生的一定時間后才出現(xiàn)，因此常不能及時作出明確的診斷?，F(xiàn)知各種表型的改變是由基因異常造成的，也就是說基因的改變是引起疾病的根本原因。基因診斷是指采用分子生物學的技術方法來分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構（DNA水平）或功能（RNA水平）是否異常，以此來對相應的疾病進行診斷?；蛟\斷有時也稱為分子診斷或DNA診斷(DNA diagnosis)?；蛟\斷是病因的診斷，既特異又靈敏，可以揭示尚未出現(xiàn)癥狀時與疾病相關的基因狀態(tài)，從而可以對表型正

36、常的攜帶者及某種疾病的易感者作出診斷和預測，特別對確定有遺傳疾病家族史的個體或產(chǎn)前的胎兒是否攜帶致病基因的檢測具有指導意義。o 基因診斷的原理及方法 （一）基因診斷的原理疾病的發(fā)生不僅與基因結(jié)構的變異有關，而且與其表達功能異常有關?；蛟\斷的基本原理就是檢測相關基因的結(jié)構及其表達功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常。由于DNA的突變、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相關基因結(jié)構變異，因此，可以直接檢測上述的變化或利用連鎖方法進行分析，這就是DNA診斷。對表達產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量變化的分析為RNA診斷(RNA diagnosis)。（二）基因診斷的方法基因診斷是以核酸分子雜交(nucleic acid

37、 molecular hybridization)和聚合酶鏈反應（PCR）為核心發(fā)展起來的多種方法，同時配合DNA序列分析，近年新興的基因芯片可能會發(fā)展成為一種很有用的基因診斷方法。 DNA診斷 常用檢測致病基因結(jié)構異常的方法有下列幾種。斑點雜交：根據(jù)待測DNA 樣本與標記的DNA探針雜交的圖譜，可以判斷目標基因或相關的DNA片段是否存在，根據(jù)雜交點的強度可以了解待測基因的數(shù)量。等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）雜交：是一種檢測基因點突變的方法，根據(jù)點突變位點上下游核苷酸序列，人工合成約19個核苷酸長度

38、的片段，突變的堿基位于當中，經(jīng)放射性核素或地高辛標記后可作為探針，在嚴格雜交條件下，只有該點突變的DNA樣本，才出現(xiàn)雜交點，即使只有一個堿基不配對，也不可能形成雜交點。一般尚合成正?；蛲恍蛄校淮笮〉墓押塑账崞巫鳛檎Ｌ结?。如果受檢的DNA樣本只能與突變ASO探針，不與正常ASO探針雜交，說明受檢二條染色體上的基因都發(fā)生這種突變，為突變純合子；如果既能與突變ASO探針又能與正常ASO探針雜交，說明一條染色體上的基因發(fā)生突變，另一條染色體上為正常基因，為這種突變基因的雜合子；如果只能與正常ASO探針雜交，不能與突變ASO雜交，說明受檢者不存在該種突變基因，如圖21-1所示。若與PCR方法

39、聯(lián)合應用，即PCR/ASO探針雜交法(PCR/ASO probe hybridization)，是一種檢測基因點突變的簡便方法，先用PCR方法擴增突變點上下游的序列，擴增產(chǎn)物再與ASO探針雜交，可明確診斷突變的純合子和雜合子。此法對一些已知突變類型的遺傳病，如地中海貧血、苯丙酮尿癥等純合子和雜合子的診斷很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的點突變。單鏈構象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP）分析相同長度的單鏈DNA因其序列不同，甚至單個堿基不同，所形成的構象不盡相同，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時速度就不同，若單鏈D

40、NA用放射性核素標記，顯影后即可區(qū)分電泳條帶。一般先設計引物對突變點所在外顯子進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性成單鏈后進行電泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、靈敏、有效地檢測DNA突變點，如圖21-2，此法可用檢測點突變的遺傳疾病，如苯丙酮尿癥、血友病等，以及點突變的癌基因和抑癌基因。限制性內(nèi)切酶圖譜（restriction map）分析，如果DNA突變后改變了某一核酸限制性內(nèi)切酶的識別位點，使原來某一識別位點消失，或形成了新的識別位點，那么相應限制性內(nèi)切酶片段的長度和數(shù)目會發(fā)生改變。一般基因組DNA經(jīng)該種限制性內(nèi)切酶水解，再做Southern印跡，根據(jù)雜交片段的圖譜，可診斷該點突變，如圖21-

41、3所示。如果用PCR擴增該突變點的外顯子，PCR產(chǎn)物經(jīng)該種酶消化后，進行瓊脂糖電泳，溴乙錠染色后可直接觀察片段的大小及數(shù)目。此法可用于檢測有些限制性內(nèi)切酶識別位點消失的遺傳疾病，如鐮狀細胞貧血?；蚧蛉笔У募膊∪绲刂泻Ｘ氀Y，單純性生長激素缺乏癥等。限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP）遺傳連鎖分析人群中個體間DNA的序列存在差異，據(jù)估計每100-200個核苷酸中便有1個發(fā)生突變，這種現(xiàn)象稱為DNA多態(tài)性。有些DNA多態(tài)性可改變某一限制性內(nèi)切酶的識別位點，因而產(chǎn)生了DNA限制性片段長度多態(tài)性。RFLP按孟德爾方式遺傳

42、，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因與特定的多態(tài)性片段連鎖，可以遺傳給子代，因此這一多態(tài)性片段可作為遺傳標記，來判斷該家庭成員或胎兒的基因組中是否攜帶該致病基因，見圖21-4，此法可用于診斷甲型血友病、苯丙酮尿癥、享延頓舞蹈病等。 DNA序列分析對致病有關的DNA片段進行序列測定，是診斷基因異常（已知和未知）最直接和準確的方法。 RNA診斷 RNA診斷主要是分析基因的表達功能，檢測轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)和量，以判斷基因轉(zhuǎn)錄效率的高低，以及轉(zhuǎn)錄物的大小。RNA印跡（Northern blot）RNA印跡是檢測基因是否表達，表達產(chǎn)物mRNA的大小的可靠方法，根據(jù)雜交條帶的強度，可以判斷基因表達的效率。RT-

43、PCR是一種檢測基因表達產(chǎn)物mRNA靈敏的方法，若與熒光定量PCR結(jié)合可對RT-PCR產(chǎn)物量進行準確測定。o 基因診斷的應用 （一）遺傳疾病現(xiàn)知遺傳疾病有數(shù)千種，但多數(shù)遺傳疾病屬少見病例，有些遺傳疾病在不同民族，不同地區(qū)的人群中發(fā)病率不同，例如鐮狀細胞貧血（sickle cell anemia）,非洲黑色人種發(fā)病率高，而囊性纖維化癥（cystic fibrosis）常見于美國白色人種，這二種遺傳疾病在我國為罕見病例。中國較常見的遺傳疾病有地中海貧血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿癥、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）、葡萄糖-6磷酸脫氫酶（G-6PD）缺乏癥、唐氏綜合癥（Downs syndrome

44、）等。根據(jù)不同遺傳疾病的分子基礎，可采用不同的技術方法進行診斷，不但可對有癥狀患者進行檢測，而且對遺傳疾病家族中未發(fā)病的成員乃至胎兒甚至胚胎著床前（preimplantation）進行診斷是否攜帶有異?；颍@對婚育具有指導意義。地中海貧血（地貧）是世界上最常見和發(fā)生率最高的一種單基因遺傳疾?。╩onogenic disease）,由于一種或幾種珠蛋白合成障礙導致類與類珠蛋白不平衡造成的，臨床以貧血、黃疸、肝脾腫大及特殊外貌為特征，地貧最常見的有兩類：地貧和地貧。地貧(-thalassemias)的分子基礎主要為珠蛋白基因缺失，也有部分病例是由于堿基突變造成的?？刹捎孟拗菩詢?nèi)切酶圖譜方法檢測珠

45、蛋白基因的缺失。人珠蛋白基因簇位于16號染色體，長度29 kb，包含7個連鎖的類基因或假基因?；颍?及2編碼序列相同，僅非編碼序列稍有差別,產(chǎn)物相同），該基因簇上有2個EcoRI識別位點，經(jīng)EcoRI酶解，進行Southern印跡，用標記的基因片段作探針，得到一條23 kb的雜交條帶，BamHI識別位點有4個，但只有14 kb片段能與mRNA基因探針雜交，見圖21-5。Hb Barts胎兒水腫綜合征：由于該病患兒二條16號染色體的4個珠蛋白基因均缺失，不能合成鏈，胎兒全身水腫、肝脾腫大、四肢短小，常于妊娠3040周死亡或早產(chǎn)后半小時內(nèi)死亡。樣本DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜分析不能顯示珠蛋白基因區(qū)

46、帶，RNA診斷也測定不出有珠蛋白基因的mRNA。缺失型HBH病：由于一條16號染色體上的兩個珠蛋白基因均缺失，另一條16號染色體上則缺失一個珠蛋白基因，并缺失3.7 kb長度的DNA片段（右側(cè)缺失型）或4.2 kb片段（左側(cè)缺失型），DNA診斷只產(chǎn)生19 kb長度的EcoRI片段，或10kb BamHI片段。標準型地貧：一條16號染色體上2個珠蛋白基因全部缺失。而另一條16號染色體上具有2個正常的珠蛋白基因，DNA診斷結(jié)果，EcoRI和BamHI都出現(xiàn)與正常一樣的23 kb或14 kb的條帶，但雜交條帶的放射性自顯影較正常人淺。地貧(-thalassemias)的基因診斷：地貧的分子基礎不同于

47、地貧，珠蛋白基因通常并不缺失，而是由于基因點突變或個別堿基的插入或缺失。每一民族和人群珠蛋白基因點突變部位不盡相同，都有特定的類型譜。（二）感染性疾病過去對感染性疾病(infectious diseases)的診斷，一是直接分離檢查病原體，或者對患者血清學或生物化學的分析。有些病原體不容易分離，有些需經(jīng)過長期培養(yǎng)才能獲得。血清學對病原體抗體的檢測雖然很方便，但是病原體感染人體后需要間隔一段時間后才出現(xiàn)抗體，并且血清學檢查只能確定是否接觸過該種病原體，但不能確定是否有現(xiàn)行感染，對潛伏病原體的檢查有困難。對感染性疾病的基因診斷具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點。80年代建立的PCR技術已廣泛應用于對病原體

48、的檢測。一般根據(jù)各病原體特異和保守的序列設計引物，有的還合成ASO探針，對病原體的DNA可用PCR技術直接檢查，而對RNA病毒，則采用RT-PCR?，F(xiàn)在市場已經(jīng)有許多種病原體的測定藥盒供應，每一盒包含擴增某種病原體的特異引物，所需的酶以及配妥的各種反應試劑，并附有可行的操作方法步驟。 病毒性感染： 多種病毒性感染都可采用基因診斷檢測相應的病原體，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可薩奇病毒、脊髓灰質(zhì)類病毒、腺病毒、EB病毒、皰疹病毒、人巨細胞病毒、乳頭狀病毒等。最近新發(fā)現(xiàn)的SARS冠狀病毒，在基因組（RNA）序列確定后，便很快建立了RT-PCR的基因診斷法。 細菌性感染： 可應

49、用基因診斷檢測多種致病性的細菌，如結(jié)核分枝桿菌、痢疾性大腸桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、綠膿桿菌等。 寄生蟲： 惡性瘧原蟲、克魯斯錐蟲、利什曼原蟲、血吸蟲、弓形蟲等都有基因診斷的方法 其它:如衣原體、支原體、真菌性感染也均用基因診斷。 （三）惡性腫瘤分析一些原癌基因的點突變、插入突變、基因擴增、染色體易位和抑癌基因的丟失或突變，可以了解惡性腫瘤的分子機制，有助于對惡性腫瘤的診斷，對腫瘤治療及預后有指導意義。(四)法醫(yī)學中的應用對生物個體識別和親子鑒定傳統(tǒng)的方法有血型、血清蛋白型、紅細胞酶型和白細胞膜抗原(HLA)等，但這些方法都存在著一些不確定的因素。近年來對人基因結(jié)構的深入研究發(fā)現(xiàn)，有些具有個體特

50、征的遺傳標記可用于個體識別和親子鑒定。1. DNA指紋分析(DNA fingerprinting)近年研究發(fā)現(xiàn)，人類基因組中許多位點存在著一種可變串聯(lián)重復序列(variable number of tandem repeat，VNTR)。這種VNTR主要存在于基因的非編碼區(qū)，重復序列是頭對尾串聯(lián)排列著。人類某些VNTR是由20-50個重復單位組成，每個單位含15-100 bp，DNA的長度為1kb至5kb，較普通衛(wèi)星DNA（約100 kb）小，所以稱為小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)VNTR有高度的多態(tài)性，在人群中的分布表現(xiàn)高度的個體特異性，甚至同一個體同源染色體

51、的等位VNTR的重復單位數(shù)也不同，等位基因按孟德爾方式遺傳。VNTR區(qū)的重復單位數(shù)目不同，所以該區(qū)的DNA長度不同。但每一位點VNTR的核心序列卻有高度的保守性，因此可認為VNTR是一種判斷個體的遺傳標記。1985年， Jeffreys根據(jù)VNTR的特點，選擇某些核心序列作為探針，并選用核心序列無切割位點的限制性內(nèi)切酶如Hinf1，對DNA樣品進行酶解，然后作Southern印跡。圖譜顯示不同個體具有不同條帶，如同人的指紋具有高度的個體特異性一樣，因此把這種Southern印跡圖稱作DNA指紋圖譜(DNA fingerprint)，如圖21-6所示。實驗證明，除同卵雙生子有相同的圖譜外，兩個人

52、不可能有完全相同的圖譜，所以這種方法對個體識別，親子鑒定，嫌疑罪犯的判斷準確可靠。圖21-7是引自文獻報道的結(jié)果?？墒荢ourthern印跡技術操作繁瑣，所需時間長，需要DNA量較大，若DNA降解還會影響對結(jié)果的判斷 。所以，Jeffreys又根據(jù)每一VNTR區(qū)翼側(cè)保守序列設計引物，用PCR方法對該區(qū)進行擴增，因VNTR長度不同，所以產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，染色后，根據(jù)條帶的不同，可以判斷結(jié)果。這種方法既方便又省時，對部分酶解DNA也適用，對單根毛發(fā)，血斑，皮屑和精跡都可進行分析。但有些VNTR重復片斷較長，PCR難以擴增。 短串聯(lián)重復(short tandem repeat,STR)多態(tài)性分析

53、 90年代初，發(fā)現(xiàn)人基因組中存在著數(shù)量眾多的STR, STR的重復單元較短，核心序列含2-4 bp，DNA片段長度為100-500 bp，故稱為微衛(wèi)星DNA (microsatellite DNA).與VNTR相同, 有不少的微衛(wèi)星DNA存在著個體間重復單元數(shù)目不同的多態(tài)性, 所以是一種應用價值很高的遺傳標記。又因為微衛(wèi)星DNA 較短，易進行PCR操作，也能適用于降解的DNA分析。目前，STR-PCR技術在法醫(yī)學中的應用已占主導地位。VNTR和STR除在法醫(yī)學中的應用外，還用于遺傳作圖, 基因定位及遺傳疾病的診斷等。 基因治療 o 基因治療的慨念 （一）基因治療的定義從基因角度可以理解為對缺陷

54、的基因進行修復或?qū)⒄Ｓ泄δ艿幕蛑脫Q或增補缺陷基因的方法。若從治療角度可以廣義地說是一種基于導入遺傳物質(zhì)以改變患者細胞的基因表達從而達到治療或預防疾病的目標的新措施。導入的基因可以是與缺陷基因相對應的有功能的同源基因或與缺陷基因無關的治療基因?；蛑委熡袃煞N形式，一種是改變體細胞的基因表達，即體細胞基因治療（somatic gene therapy），另一種是改變生殖細胞的基因表達，即種系基因治療（germline gene therapy），從理論上講，若對缺陷的生殖細胞進行矯正，不但當代可以得到根治，而且可以將正常的基因傳給子代。但生殖的生物學極其復雜，且尚未清楚，一旦發(fā)生差錯將給人類帶

55、來不可想象的后果，涉及一系列倫理學的問題，目前還不能用于人類。在現(xiàn)有的條件下，基因治療僅限于體細胞，基因型的改變只限于某一類體細胞，其影響只限于某個體的當代。（二）基因治療的方式基因治療的方式（type of gene therapy）主要有3類，一類為基因矯正或置換，即對缺陷基因的異常序列進行矯正，對缺陷基因精確地原位修復，或以正?；蛟恢脫Q異?；?，因此不涉及基因組的任何改變，目前尚無體內(nèi)成功的報道。另一類為基因增補，不去除異?；颍峭ㄟ^外源基因的導入，使其表達正常產(chǎn)物，從而補償缺陷基因的功能。再有一類為基因封閉，有些基因異常過度表達，如癌基因或病毒基因可導致疾病，可用反義核酸技術、

56、核酶或誘餌（decoy）轉(zhuǎn)錄因子來封閉或消除這些有害基因的表達。除上述3大類外，近日發(fā)展其它多種形式，如導入病毒或細菌來源的所謂“自殺基因”或經(jīng)過改造的條件性復制病毒，只能在p53缺陷的腫瘤細胞繁殖以達到溶解腫瘤細胞。（三）導入的方式導入基因有兩種方式，一種是體外導入（ex vivo）,即在體外將基因?qū)爰毎麅?nèi)，再將這種基因修飾過的細胞回輸病人體內(nèi)，使這種帶有外源基因的細胞在體內(nèi)表達，從而達到治療或預防的目的。被用于修飾的細胞可以是自體，同種異體或異種的體細胞。合適的細胞應易于從體內(nèi)取出和回輸，能在體外增殖，經(jīng)得起體外實驗操作，能夠高效表達外源基因，且能在體內(nèi)長期存活。目前常用的細胞有淋巴細胞

57、、骨髓干細胞、內(nèi)皮細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、肌細胞、角朊細胞（keratinocyte）、多種腫瘤細胞等。另一種是體內(nèi)導入（in vivo），即將外源基因直接導入體內(nèi)有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。o 外源治療基因 無論是ex vivo或in vivo導入基因的方式，首先要選擇合適的能達到治療或預防用的目的基因。如導入遺傳疾病所缺陷的基因或增強機體免疫的細胞因子基因。目前用于臨床試驗的治療基因主要為該基因的c DNA。一些臨床試驗用的基因見表21-1作為外源治療基因的條件：基因的大小要根據(jù)所用載體（vector）能夠運載的容量；若為分泌性產(chǎn)物需含信號肽序列；cDNA序列應正確無誤；翻譯時要求有起始密碼子及終止密碼子。