單克隆抗體制備流程

1、.單抗制備流程 1975年，kohler和milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無(wú)限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。制備單克隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的一系列實(shí)驗(yàn)步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法。一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備(一)免疫方案選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的mcab至關(guān)重要。一般要在融合前兩

2、個(gè)月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。1.顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫1100.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)23周后第二次免疫1100.5ml ip精品.3周后加強(qiáng)免疫(融合前三天)1100.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。初次免疫 ag150

3、g加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射(一般0.81ml0.2ml點(diǎn))3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip(ip劑量不宜超過(guò)0.5ml)3周后第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip (57天后采血測(cè)其效價(jià)，檢測(cè)免疫效果)精品.23周后加強(qiáng)免疫，劑量50500g為宜，ip或iv3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)抗原反應(yīng)性。(二)飼養(yǎng)細(xì)胞在制備單克隆抗體過(guò)程中

4、，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3t3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長(zhǎng)期保存，隨用隨復(fù)蘇。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用balbc小鼠610周齡精品.拉頸處死浸泡于75酒精，消毒35分鐘用無(wú)菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無(wú)菌注射器注入68ml培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)分離心56分鐘用20小牛血清(ncs)或胎牛血清(fcs)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1

5、10ml加入96孔板，100l孔精品.放入37co2孵箱培養(yǎng)一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得58106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞濃度為5106ml，小鼠脾細(xì)胞為1106ml，小鼠的成纖維細(xì)胞(3t3)1105ml，均為100l孔。(三)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量mcab。常用骨髓瘤細(xì)胞系有：ns1、sp20、x63 ag8.653等。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如rpmi1640，dmem培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在1020，細(xì)胞的最大密度不得超10ml，一般擴(kuò)大

6、培養(yǎng)以110稀釋傳代，每35天傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為1620小時(shí)，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長(zhǎng)，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對(duì)hat的敏感性，每36月應(yīng)用8ag(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。精品.(四)免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中b淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)b淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。脾細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下取出脾臟，用不完

7、全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的倍，細(xì)胞數(shù)為10左右。二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤(一)細(xì)胞融合流程(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)胞sp20，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(2)同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(3)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。(4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響peg的濃度。(5)輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。精

8、品.(6)在室溫下融合:30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45peg(merek,分子量4000)含5dmso，邊加邊攪拌。作用90秒鐘，若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至120秒鐘。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止peg作用，每隔分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。(7)離心，800rpm，6分鐘。(8)棄上清，先用6ml左右20小牛血清rpmi1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。(9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。(10) 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100l孔，37、5co2孵箱培養(yǎng)。一般一塊96孔板含有11

9、07脾細(xì)胞。(二)hat選擇雜交瘤應(yīng)用hat 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加hat選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度。精品.一般在融合24小時(shí)后，加hat選擇培養(yǎng)液。ht和hat均有商品化試劑50貯存，用時(shí)1ml加入50ml20小牛血清完全培養(yǎng)液中。因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200l孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加3倍量的hat。我們認(rèn)為，融合后最初補(bǔ)加的量可用全量的23進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。50hath:510-3ma:210-5mt:810-4m一般選擇hat選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用ht培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)

10、液。三、抗體的檢測(cè)篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底110面積時(shí)，即可開始檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。檢測(cè)抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法為原則。精品.常用的方法有:1.elisa用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等mcab的檢測(cè)。2.ria用于可溶性抗原、細(xì)胞mcab的檢測(cè)。3.facs(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的mcab檢測(cè)。4.ifa用于細(xì)胞和病毒mcab的檢測(cè)。上述方法均為一般實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實(shí)

11、驗(yàn)過(guò)程?？煽康暮Y選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個(gè)篩選時(shí)機(jī)。四、雜交瘤的克隆化和凍存克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過(guò)hat篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中，可能會(huì)有數(shù)個(gè)甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞

12、也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。精品.(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。1.有限稀釋法的程序制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1510ml取130個(gè)細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞ml，100l孔加a、b、c三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)ml，100l孔加d、e、f三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個(gè)ml，100l孔，加g、h兩排，為每孔0.5

13、個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，補(bǔ)加完全培養(yǎng)液200l孔。第89天時(shí)，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加ht。2.軟瓊脂法軟瓊脂的配制精品.含20fcs(小牛血清)的2倍濃縮的rpmi16401瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。0.5瓊脂：由1份1瓊脂加1份含20小牛血清的2倍濃縮的rpmi1640配制而成。置42保溫。用上述0.5瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。按100ml，500ml或5000ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。1ml 0.5瓊脂液(42預(yù)熱)在室溫中

14、分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合?；靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37，5co2孵箱中。45天后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。檢測(cè)抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時(shí)再克隆化。(二)雜交瘤細(xì)胞的凍存及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)樵跊](méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候，細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒(méi)有原始細(xì)胞的凍存，則因?yàn)樯鲜龅囊馔舛ΡM棄。精品.雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1106以上，但對(duì)原始孔

15、的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí)，一孔就可以凍一支安瓿。細(xì)胞凍存液:50小牛血清40不完全培養(yǎng)液10dmso(二甲亞砜)凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0，再降溫時(shí)一般按每分鐘降溫23，待降至-70可放入液氮中?；蚣?xì)胞管降至0 后放-70超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)

16、液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高。精品.2.體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清。實(shí)體瘤法對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按13107ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共24點(diǎn)。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般1020天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mgml。但采血量有限。腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlpristane(降植烷)或液體石臘于balbc鼠，12周后腹腔注射1106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動(dòng)物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110ml腹水。也

17、可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來(lái)，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。六、單克隆抗體的鑒定對(duì)制備的mcab進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定:1.抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進(jìn)行抗體的檢測(cè)外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用elisa、ifa法。例如制備抗黑色素瘤細(xì)胞的mcab，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株

18、的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。精品.2.mcab的ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時(shí)，已經(jīng)基本上確定了抗體的ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠igg或igm，則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是igg類或igm類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心elisa來(lái)確定mcab的亞類。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的peg(3)，將有利于沉淀線的形成。3.mcab中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定mcab的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒mcab的中和活性，則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏感的細(xì)胞，來(lái)觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的

19、保護(hù)。4.mcab識(shí)別抗原表位的鑒定：用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法，測(cè)定mcab所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定mcab的識(shí)別的表位是否相同。5.mcab親和力的鑒定：用elisa或ria競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定mcab與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。七、影響因素、失敗原因分析由于制備mcab的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。其主要失敗原因和影響因素有:1.污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理。