第十三章熒光分析法

1、第十三章 熒光分析法 用熒光來進(jìn)行定性定量的分析法熒光分析法 光照 分子基態(tài) =激發(fā)態(tài) 輻射躍遷 熒光若光源是：可見一紫外光源分子熒光分析法 由熒光波長可確定物質(zhì)分子具有結(jié)構(gòu) 由熒光強(qiáng)度可測定物質(zhì)含量原子特征光譜作光源原于熒光分析x射線作光源x射線熒光分析熒光分析法與可見紫外、紅外比較：均屬于分子光譜 熒光 可見紫外、紅外本質(zhì) 發(fā)射光譜 吸收光譜靈敏度 10-810-10g/ml 10-510-7g/ml 選擇性 高 一般 但儀器價(jià)格昂貴第二節(jié) 基本原理一、 分子熒光的發(fā)生過程（1）熒光和磷光熒光：由第一激發(fā)態(tài)單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)回到基態(tài)任一振動(dòng)能級(jí)就發(fā)射的光譜。1、三線態(tài)：總自旋S=1，由自

2、旋，由多重性M=2S+1=3這樣的分子受激后， 產(chǎn)生能級(jí)分裂，這受激態(tài)為三線態(tài)。單線態(tài)：總自旋S=0，兩個(gè)電子自旋相反，M=2S+1=1解釋：大多數(shù)分子偶數(shù)電子，基態(tài)時(shí)，這些電子存在于各個(gè)原子軌道，成對自旋，方向相反，電子凈自旋等于0（S=0），因此是抗磁性的其能級(jí)不受外界磁傷影響而分裂。這種電子能態(tài)為單線態(tài)，多重性M=2S+1=1。當(dāng)基態(tài)分子的一個(gè)成對電子吸收光能而被激發(fā)的過程中，自旋方向不變，此時(shí)的激發(fā)態(tài)為激單線態(tài)。若一個(gè)電子在激了態(tài)上自旋方向有改變，即自旋方向相同，則分子中電子的凈自旋等于1（S=1），這樣的分子在磁場中受影響而分裂，M=2S+1=3，這種受激態(tài)為三線態(tài)。E： 躍遷 躍遷

3、單線態(tài) 單線態(tài)單線態(tài) 三線態(tài)（自旋方向改變）躍過幾率：-1（若看作1） 10-6（光學(xué)禁阻、幾率?。?、 熒光與磷光的產(chǎn)生：激發(fā)態(tài)基態(tài) 共四五條途徑（若包括磷光產(chǎn)生）振動(dòng)馳豫：（非輻射躍遷）從電子激發(fā)態(tài)的某一振動(dòng)能級(jí)到達(dá)同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的過程為。發(fā)生在同一個(gè)激發(fā)態(tài)的電子能級(jí)上。P59，圖14-1（b） 此過程反10-11-10-13秒， 熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)態(tài)單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)而了射的光量于為熒光。（因可停在基態(tài)任振動(dòng)能級(jí)上，得到的熒光譜線是幾個(gè)非?？拷姆逯?，進(jìn)一步振動(dòng)馳豫，很快回到V=0）若發(fā)射熒光幾率高，發(fā)射過程快10-7-10-6秒說明一點(diǎn)：熒

4、光沒長比激發(fā)波長要長，是因?yàn)榉祷鼗鶓B(tài)是由第一激發(fā)態(tài)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)，而在被激的電子由激發(fā)態(tài)單線較高振動(dòng)能級(jí)最低振一時(shí)，已損失一部分能量（振動(dòng)馳豫以熱形式損失掉一部分）。P59圖14-1（d） 內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換：（非輻射躍遷）受激分子將能量轉(zhuǎn)變?yōu)榉橇孔踊臒崮芏拥诫娮踊鶓B(tài)。第二電子激發(fā)態(tài)單線態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)單線態(tài)基態(tài)單線態(tài)。 E0 E小P59圖14-1（S2能級(jí)量好修正一下）第一電子激態(tài)S1的較高振動(dòng)能級(jí)與第二電子激發(fā)態(tài)S2的低振動(dòng)能及相重迭，內(nèi)部轉(zhuǎn)換易發(fā)生。10-1-10-13秒可完成。內(nèi)部 ：內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換后，分子通過一系列振動(dòng)馳豫回到基態(tài)最低振動(dòng)能吸。注意：盡管使分子激發(fā)的波長有長有短，但發(fā)

5、射熒光的波長是一樣的。（同一物質(zhì)而言），且熒光波長比激發(fā)波長長。三線態(tài)上兩個(gè)激發(fā)態(tài)也會(huì)發(fā)生內(nèi)部能理轉(zhuǎn)換。 體系間跨越： 激發(fā)態(tài)單線態(tài)激發(fā)態(tài)三線態(tài)P59 14-1（e） 受激分子的電子在激發(fā)態(tài)發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而改變多重性的過程與內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換一樣，當(dāng)激發(fā)態(tài)的單線態(tài)S1最低振動(dòng)能級(jí)與跨越后，熒光量子減弱甚至?xí)晒庀纭＠汉卦樱↖，Br）的分子 自旋與軌道運(yùn)動(dòng)相互作用 易發(fā)生體系間躍遷，使熒光減弱甚至熄滅。 溶液中有O2 O2順磁性物質(zhì) 總之，處于激發(fā)態(tài)的分子可通過四個(gè)途徑回到基態(tài)，具體有無熒光發(fā)生，要看后三種途徑哪種速度快幾率大。2、 熒光量子效率： 顯然： 一般 3、 熒光與磷光比較：A熒光磷

6、光成因激發(fā)單線態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)單線態(tài)激光三線態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)單線態(tài)E 照射后發(fā)射時(shí)間 10-7-10-18秒 10-3-10秒共振熒光：當(dāng)熒=激時(shí)的熒光為共振熒光。遲帶熒光：處于激發(fā)三線態(tài)的某些分子還可以通過又一次體系間跨越回到激發(fā)單線態(tài)，繼而再發(fā)射熒光回到基態(tài)。在室溫下，磷光一般不易呈現(xiàn)，若安測磷光應(yīng)在低溫下，儀器應(yīng)有低溫設(shè)施。二、激發(fā)光譜與熒光光譜： 熒光發(fā)射各個(gè)方向都可測，為了防止透過示干擾，在其垂直的方向測熒光。1、激發(fā)光譜：（與吸收光譜類似）固定發(fā)射光波長發(fā)（即第二個(gè)單色固定），依次改變激發(fā)波長激測熒光強(qiáng)度F，以F-激作得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。P61圖14-4虛線 P6214-52

7、、熒光光譜： 固定激發(fā)光波長激（即第一個(gè)單色器固色），依次改變發(fā)射波長發(fā)（即第二個(gè)單色器改變）測F、以F-發(fā)作圖得熒光光譜。P61圖14-4實(shí)踐 P62 14-5（實(shí)） 熒光光譜上熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長就是熒光發(fā)射波長。即電子回到基態(tài)時(shí)以發(fā)射這個(gè)能量的幾率最大。 激發(fā)光譜上熒光強(qiáng)度最強(qiáng)時(shí)的波長作激發(fā)光源可得到強(qiáng)度最大的熒光。 實(shí)驗(yàn)測得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與紫外吸收光譜形狀相似。是由于熒光物質(zhì)吸收于這種波長的紫外光，才發(fā)射出熒光。吸收愈強(qiáng)，發(fā)射的熒光也愈強(qiáng)。區(qū)別在于吸收光譜測A，而激發(fā)光譜測F。，而有書則認(rèn)為二者光譜一致，只不過以F代替了A即激發(fā)光譜是表觀吸收光譜，經(jīng)校正后可以一致。說明： 若熒光物質(zhì)

8、的激光譜有兩個(gè)或兩個(gè)以峰時(shí)，不管使作哪個(gè)波長激發(fā)光源的波長，其熒光光譜的形狀和峰高是相同的。 熒光光譜與激發(fā)光譜互為鏡象。P62圖14-5 葸 圖14-6對應(yīng)看懂 圖14-1看懂則本章基本內(nèi)容已掌握。激發(fā)光譜： E 熒光光譜 E b0：基態(tài)V=0第一激發(fā)態(tài)V=0 遞 遞 Co:1激發(fā)態(tài)V=0基態(tài)V=0遞 遞C0：1激發(fā)態(tài)V=0基態(tài)b1：基態(tài)V=0第一激發(fā)態(tài)V=1 增 減 C1： V=0 V=1 增 減b2：基態(tài)V=0第一激發(fā)態(tài)V=2 C2： V=2 V=2P6圖14-5是高分辨儀器打擊，所以可看出一高的峰。由此圖可看出 像關(guān)系。A峰由圖141解釋：由S0S2（精細(xì)結(jié)構(gòu)）思考：若分別選01，02

9、等做激發(fā)波長，能否得到類似的熒光光譜？答：可以。峰形、峰位相同，只不過F不同。原因發(fā)射熒光均由第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)各。二、分子結(jié)構(gòu)與熒光：1、 兩個(gè)必備條件： 分子一定要能吸收紫外，可光見光及具有吸光結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)中有*，n*，而*引起是弱吸收，不足以發(fā)射熒光。故實(shí)際上發(fā)射發(fā)射熒光分婦應(yīng)有*k帶，尤其是共軛強(qiáng)吸收時(shí)，熒光產(chǎn)生。 有較高的熒光量子效率。2、 結(jié)構(gòu)與熒光：（1）具有共軛雙鍵和分子有利于發(fā)射熒光。 *，大，；*，小，小 電子共軛度增大，熒。 例：ex 激 205 268 356 nmem 熒 278 321 404 nmf 0.11 0.29 0.36 （2）平面剛性高的剛性結(jié)構(gòu)

10、分子熒分子熒光強(qiáng)例（3）空間位阻：其實(shí)質(zhì)仍為剛性共面問題。1-二甲基胺基-磺酸鹽 1-二甲胺基-8磺酸鹽=0.75 =0.03 (4)取代基影響：斥電子基團(tuán)引入，9（-NH2，-OH，-OCH3等）吸電子基團(tuán)引入，（-COOH，-NO2，-cl等）減弱軛體系。影響不大：-SO3H，-NH3+，-R二、影響熒光的外界因素：1、溫度：低溫，。（T分子運(yùn)動(dòng)加快，磁撞幾率無輻射躍遷）例：某熒光物質(zhì)乙醇液：O時(shí)以10，F(xiàn)3%，降至-80時(shí)，1原因：T，分子動(dòng)能，非輻射失活。2、溶劑：溶劑介電常數(shù)，極性 n*,E, * E, 溶劑含量原子或溶液、溶解氧（CBr4,C2H5I等），體系間跨越。使，甚至熄滅。

11、溶劑粘度，F(xiàn) 3、pH的影響： 無熒光 蘭色熒光 無熒光3、 熒光熄滅劑的影響：54、激光光的影響：光閘不能常開，與可見紫外不能常開不太相同，可見紫外是防止光敏元件損壞而此處主要防止樣品分解。65、熒光物質(zhì)濃度要稀，C時(shí)，偏離線性。76、散時(shí)光影響：Ray/elgh,Raman瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性磁撞時(shí)，不發(fā)生能量交換，僅光子方向改變，這種散解光為Ray/elgh,其波長與射光相同。拉漫光：光子和物質(zhì)發(fā)生非彈性磁撞，光子改變方向同時(shí)，與物質(zhì)有能量交換，散射光波長有所改變，這種光為 。兩種散射的波長位置與熒光波長非常接近，常影響熒光純度。由圖，當(dāng)有350nm激發(fā)時(shí)，400nm處的Raman

12、光被熒光掩蓋而影響熒光純度，有時(shí)還會(huì)使最大發(fā)射熒光波長產(chǎn)生偏移。而以320nm激發(fā)時(shí)，兩散射光均不干擾。故：在測定時(shí)，安準(zhǔn)確選擇激發(fā)波長，即要產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度，又有能讓熒光波長產(chǎn)生偏移。寧可犧牲一些熒光強(qiáng)度也要保證熒光純度。如何選擇激一熒： 激 選max激發(fā)光譜發(fā) 選max熒光光譜 激與發(fā)要有一定距離，避免溶劑散射光干涉。第三節(jié) 熒光定量分析一、熒光強(qiáng)度與濃度關(guān)系： 熒光強(qiáng)度F與溶液吸收光能和程度以及溶液中熒光物質(zhì)的量子效率有關(guān)。 熒光強(qiáng)度F與被測物質(zhì)吸收光的強(qiáng)度成正比。受激后，可在各個(gè)方向發(fā)射熒光在透過光的方向不易測定F。F=K，（I0-I）由Beer定律：=10-Rcl則：F=K，I0（1

13、-10-Rcl）= K，I0（1-e-2.3Ecl）將e*級(jí)數(shù)泰勒展開：有：F=K，I01-（1+）當(dāng)濃度很小時(shí)，Ecl很小，當(dāng)Ecl0.05時(shí)，級(jí)數(shù)中第二項(xiàng)以后可以忽略。F=K，I02.3ELC即：F=KC 條件：C小，使Ecl0.5，產(chǎn)生偏離。二、熒光分析靈敏度：對于熒光法FI0 I0 F FC只要檢測器靈敏，可檢測微弱信號(hào)。而對于分光光度法的吸收光譜，C極小時(shí)，I/I01 A0無吸收若C不變，改變射光I0，則無用吸收光譜受一定限制，靈敏度小于熒光光譜。二、分析方法：1、 工作曲線法：（與可見紫外對照講）C0 C1 C2 吸收曲線（可紫）找max 激發(fā)曲線（可紫）找 激 對照可見紫外： A

14、0 A1 A2 測F， 可紫外測A熒 光： F0 F1 F2 回歸 測定2、 比例法：取已知量的純凈熒光物質(zhì)配一標(biāo)液，使?jié)舛仍诰€性范圍內(nèi)，測Fs。同樣條件下測試樣Fx(若空白液的熒光強(qiáng)度調(diào)不到0%時(shí)，應(yīng)扣除空白F0。則： （F0后類似于可見紫外中A0應(yīng)扣除）3、 校正儀器：選擇某種標(biāo)準(zhǔn)溶液校正，如：硫酸奎寧（0.05MH2SO4）mg/ml其F值天天不變，用其調(diào)F100%（類似于pH要定位）。第四章 儀器一、熒光計(jì)主要部件：（與可見紫外對照）Vis.VV光源單色器樣品池檢測器記錄熒光 光源單色器樣品池單色器2檢測器記錄1、 激發(fā)光源：高壓 365nm低壓Hg燈，產(chǎn)生線光譜 254nm 氙燈，產(chǎn)生連續(xù)光譜250-700nm其中300-400射線強(qiáng)度幾乎相同。2、 單色器：激發(fā)濾光片（第一濾光片）：在光源和樣品池之間，將不需要的光濾去。熒光濾光片（第二濾光片）：在樣品池與檢測器之間，只讓所發(fā)射熒光照射到檢測器上。目前的熒光分光光度計(jì)，用光柵作單色器；光電熒光計(jì)用濾光片。3、 檢測器：光電倍增管4、 樣品池：低熒光的玻璃or石類制成，四面透光。二、熒光種類： 光電熒光計(jì) 熒光分光光度計(jì)激發(fā)光源 汞燈 氙燈激發(fā)單