免疫膠體金技術(shù)（醫(yī)藥相關(guān)）

1、免疫膠體金技術(shù)Immune colloidal gold technique,1,醫(yī)藥 Determined the minimum amount of protein ; Final conjugation Purification,15,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),Adjust the gold colloid to the proper pH,膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。 需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1

2、N HCl。測(cè)定金溶液的pH可能損害pH測(cè)定計(jì)的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測(cè)定其pH即可,16,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),蛋白 與膠體金結(jié)合的最佳pH測(cè)定,取若干1.5ml的試管，分別加入1ml膠體金 用K2CO3將pH分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10； 去96孔培養(yǎng)板，按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100ul加入孔中，重復(fù)三次； 每孔分別加入20ul濃度為10%的NaCl溶液，混合，室溫下放置10min； 觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH,17,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),Adjust the gold colloid to the proper pH,常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值

3、,18,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),Determined the minimum amount of protein,1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測(cè)定，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45g/ml,19,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),2）目測(cè)法：以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后（由5g4

4、5g另設(shè)對(duì)照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進(jìn)行,20,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),1. Pipette 1ml of colloid into each of a series of 3ml clean plastic tubes. 2. Adjust the antibody (0.1ug/ul) to the proper pH with 100nM K2CO3 or 100mM HC1. 3. Add the antibody to each tube in a series from 0-150ul (i

5、e 0-15ug in steps of 0, 1, 2, 3 .15ug). 4. Shake each tube and leave for approximately 5 minutes to conjugate. 6. To each tube add 100ul of 10% NaC1 and agitate for 1 minute. 7. The Tube containing the minimum amount of protein required to stabilize the gold sol is indicated by the one in which the

6、color of the gold sol does not change from red to blue upon the addition of NaCl,21,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),Final conjugation (IgG,Take 100ml of gold sol and adjust to Ph9 Adjust the dialyzed and centrifuged antibody solution (0.1ug/ul) to pH9.2 Add the determined amount of antibody solution dropwise to the gold whil

7、e stirring rapidly After 5 minutes add 10ml of filtered 10% BSA at pH9 and stir gently for 10 minutes,22,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),Purification,The gold conjugate must be purified from excess antibody and any small clusters removed before concentrating and storing. Spin the gold conjugate at speeds according to gold pa

8、rticle size . The gold conjugate will form a loose precipitate at the bottom of the tube. Discard the clear supernatant and resuspend the pellet with proper buffer,The gold conjugate, if correctly made, will be stable at 4 for several months.If long term storage is required is should be aliquoted in

9、to 1ml volumes and 20% glycerol added. It may then be frozen and kept at -20 for years,23,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),膠體金免疫層析法試劑的組成,24,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),樣品墊(Sample pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無(wú)紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。 樣品墊的作用： 減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布； 去除樣品中雜質(zhì)顆粒； 調(diào)節(jié)樣品液pH值或粘度等,樣本墊可使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗(yàn)的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹⒄承栽鰪?qiáng)劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避

10、免使用復(fù)雜辨識(shí)劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測(cè)一步完成,25,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),結(jié)合墊(Conjugate pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無(wú)紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。 結(jié)合墊的作用主要為： -吸附一定量的金標(biāo)結(jié)合物顆粒； -吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上； -保持金標(biāo)結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性； -保證金標(biāo)結(jié)合物顆粒定量完全釋放等,26,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),硝酸纖維素膜( Nitrocellulose)： 推薦使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等國(guó)外公司的硝酸纖維素膜。 NC膜的作用： - 在檢測(cè)線和對(duì)照線條帶區(qū)域固定抗體； -樣品在NC膜上流動(dòng)并與試劑混合發(fā)生免疫反應(yīng)

11、； -反應(yīng)在NC膜上顯色，讀檢測(cè)結(jié)果 NC膜的重要參數(shù)： 孔徑、對(duì)稱性、層析速度、表面活性劑、蛋白結(jié)合力、強(qiáng)度、表面質(zhì)量、厚度、批間均一性等,27,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),硝酸纖維素膜與蛋白結(jié)合的原理 主要有兩種假說(shuō)： 1）首先兩者靠靜電作用力結(jié)合，然后靠H鍵和疏水作用來(lái)維持長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合。 2）首先兩者靠疏水作用結(jié)合，然后靠靜電作用來(lái)維持長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合。兩條假說(shuō)，都表明其結(jié)合過(guò)程分為兩步，首先結(jié)合和后面長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合。由于結(jié)合原理的不明確性，導(dǎo)致在這方面的工作非常依賴實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),28,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),硝酸纖維膜的選擇,膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(m和s) m: 指的是膜孔徑， s: 以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時(shí)間是*s.

12、 換算情況大致為：8um=135s；6um=180s 不同秒數(shù)的膜對(duì)反應(yīng)的影響 通過(guò)速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時(shí)還有一個(gè)問(wèn)題是，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。 135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競(jìng)爭(zhēng)法,29,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),如何選擇 物理性能 膜的物理性能主要是2個(gè)參數(shù)， 膜厚度和寬度 厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴(kuò)散性能，點(diǎn)出來(lái)的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速； 寬度(檢測(cè)區(qū)的長(zhǎng)度)和爬速及靈敏度的關(guān)系 跑水性能 注入足夠溶液到槽內(nèi)，將不同批次膜每隔1cm做一次標(biāo)記（總長(zhǎng)大于4cm）并放到傾斜支架，整個(gè)支架下端放入溶液槽，膜開(kāi)始吸液，計(jì)時(shí)。記錄每個(gè)標(biāo)記處的通過(guò)時(shí)刻，并與對(duì)照組比較。跑板時(shí)，理論上溶液呈水平線形式上吸，觀測(cè)是否有波浪傾斜或包圍潤(rùn)濕等反?，F(xiàn)象。 點(diǎn)樣測(cè)試 C/T線出線時(shí)間和靈敏度,30,醫(yī)藥&醫(yī)學(xué),片材： 不干膠塑料襯底，片材的質(zhì)量很大程度上影響了產(chǎn)品的貨架期,吸收墊(Absor