實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌基因組DNA的提取.ppt

1、細(xì)菌基因組DNA的提取,一、實(shí)驗(yàn)原理,1、核酸的分類,DNA 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。 RNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA,核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng): 盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取時(shí)間。 減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。 減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解,核酸制備的步驟,核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶

2、抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。 對(duì)于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。 對(duì)于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要,3、核酸制備的一般方法和原理,DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活,RNase抑制 操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理 低溫操作 在分離過(guò)程中要加入一定的RNase抑制劑,核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)

3、。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2溶解核小體上的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)； 3對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用,如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉,核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用,如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC,核酸制備中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶,細(xì)胞破碎 抽提去蛋白質(zhì)

4、 沉淀核酸,核酸提取的一般過(guò)程,細(xì)胞破碎 機(jī)械方法： 超聲波處理法、研磨法、勻漿法； 化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。 DNA提取 SDS（十二烷基硫酸鈉 ）法 ：SDS是有效的陰離子去垢劑, 細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間 常借靜電引力或配位鍵結(jié)合, SDS能夠破壞這種價(jià)鍵。 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨 ）法 ：CTAB是一種陽(yáng)離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來(lái)，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。 DNA純化（去雜質(zhì)） 蛋白質(zhì)： 常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。 RNA ：

5、常選用RNase消化 ，或是用LiCl來(lái)消除大分子的RNA。 酚類物質(zhì)： 提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1PVP,核酸提取的一般過(guò)程,核酸樣品的保存 溫度： 4（5）最佳和最簡(jiǎn)單 -70是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存 -20保存 保存介質(zhì)： TE緩沖溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,二、材料、設(shè)備及試劑,菌種 ：大腸桿菌 設(shè)備 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 臺(tái)式高速離心機(jī)， 渦旋振蕩器，水浴鍋（ 37 、60 ） 試劑：LB液體培養(yǎng)基 、RNA酶A 、無(wú)水

6、乙醇 無(wú)菌水（或TE）緩沖液、 10%的SDS、 20mg/ml的蛋白酶K，、5mol/L NaCl、酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、異丙醇、 75%乙醇、 CTAB/NaCl溶液(CTAB:5gCTAB溶于100ml0.5molNaCl中，加熱到65度溶解。,1、培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.2ml的培養(yǎng)物離心12000rpm,1min。 2、沉淀物加入570ul的無(wú)菌水（或TE）緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入30ul 10%的SDS和10ul 20mg/ml的蛋白酶K，混勻，于37溫育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。 3、加入100ul 5mol/L

7、 NaCl,充分混勻，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混勻，于60 溫育10min。(上下顛倒混勻)，離心，12000rpm,5min。 4、取上清，加入等體積（約800ul）的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），混勻，離心12000rpm,5min，將上清液轉(zhuǎn)至新管中。（抽提兩次） 5、加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，靜止10分鐘，離心,12000rpm,10min 。 6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗滌，離心5min，棄上清液，重懸于30ul的無(wú)菌水（或TE）緩沖液,三、操作步驟,四、注意事項(xiàng)材料準(zhǔn)備,最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融,四、注意事項(xiàng)細(xì)胞裂解,材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低 針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式： 植物材料液氮研磨 動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨 組培細(xì)胞蛋白酶K 細(xì)菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩,四、注意事項(xiàng)核酸分離、純化,采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔 離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間 針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法,四、注意事項(xiàng)核酸沉淀、溶解,當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分 沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH