第節(jié)藻種分離和保存

1、第四節(jié) 藻種的選擇、分離、培養(yǎng)和保存,一、選 種,1 選種的意義 選擇出合乎人們生產(chǎn)需要的優(yōu)良品種。 所選擇的生物種應具有下列特征： 生長迅速； 對極端的溫度和輻射條件的耐性范圍大； 蛋白質，脂類和糖類含量高，或有選擇地積累一種特殊的代謝產(chǎn)物（如甘油）； 無毒性，且易于收獲。,2種和品種 ( l ）種：生物分類上的基本單位 ( 2 ）品種：同一種生物個體，受環(huán)境影響會形成一些性狀差異，具有各種性狀差異的個體被區(qū)分開，稱“品種”,3選育種的方法 （ l ）選擇育種：在單細胞藻類生產(chǎn)的過程中，不經(jīng)過人為的處理而是利用其自然發(fā)生變異，有目的地、定向地把具有符合生產(chǎn)要求的優(yōu)良性狀（生活力強、生長快、繁

2、殖快、耐高溫等）的藻種留下進培育。 （ 2 ）誘變育種：通過誘變劑處理（亞硝酸、鈷60、快中子、氯化鋰、紫外線等），使藻細胞發(fā)生大量變異從中選出具有優(yōu)良性狀的變異個體。,4接種： 液體接種：將藻液直接加入培養(yǎng)液中進行攪拌，加入的藻種分量視水溫而定，水溫較低（10）時多加，約占培養(yǎng)液總量的3040左右；水溫適宜時（2530），可加58左右。 干藻接種是用干藻的藻體接種，接種量為0.10.2。,二、藻種分離,1意義：為了要進行某種藻類的科學研究或大量培養(yǎng)，有必要把某種藻類與其他生物分離。 因為在培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中要受敵害生物的污染，只有分離出”純種”進行培養(yǎng)，才能獲得好效果。,2 、藻種的單種培養(yǎng)和

3、純種培養(yǎng) ( 1 ）單種培養(yǎng)：分離培養(yǎng)的藻種雖然只有一種，但還混雜細菌的生長。 ( 2 ）純種培養(yǎng)：分離培養(yǎng)的藻種，僅只有藻種一種，而且無其它生物混雜。,3 藻種的采樣及預備培養(yǎng) （l）決定分離培養(yǎng)的種類 （2）采用含有該藻種的水樣（用 25 號網(wǎng)采集或刮取附著藻類） （3）鏡檢采回水樣,( 4 ）預備培養(yǎng)： 培養(yǎng)液：濃度小，為原配方的1/2 、1/3、1/4 ，對難培養(yǎng)的藻類要加入土壤浸出液：如果水樣中各種種類多，就要用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適宜培養(yǎng)液中繁殖 容器：三角燒瓶、試管（250ml 瓶中加入 100ml 培養(yǎng)液） 管理：每天搖動一次,4 藻種的分離方法 1離心法： 將混合液用離

4、心機離心，水中不同藻體及細菌就以不同的速度下沉，因此得以分開。 將不同時間下從導管底的藻體取出，經(jīng)鏡檢選定某種藻類最多的沉積物，再加清水，繼續(xù)離心，如此反復就可得到比較單純的藻體，再接種相應培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 優(yōu)點：可消除細菌，并增加純粹分離的可能性，至少可作為藻種平板培養(yǎng)的準備工作。另外，在水液中藻體含量較少時，可用此法集中藻體。 缺點：不能做到使不同藻類完全分離。,* 2稀釋法：該法源于中野治房（1933）的方法。用已消毒試管5只，在第1管盛蒸餾水10mL，第25管都裝5mL，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，第1管用滴管滴入混合藻液12滴，充分振蕩，使均勻稀釋。次用消毒吸管，從第1管中吸取5mL滴入

5、第2管中如前振蕩，使均勻稀釋充分震蕩后再取5毫升到第三支試管中，如此直至第五個試管。然后把五個已盛有消毒的瓊膠培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，加熱使之溶解，待冷卻而尚未凝固時，分別滴入五個試管的藻液各一滴，用力振蕩，使藻液充分混入培養(yǎng)基中。待冷凝后，把五個培養(yǎng)皿放在受著漫射光窗口，一直到出現(xiàn)藻群時為止。在20左右時，約10天即出現(xiàn)藻群。用消過毒的白金絲取些藻群，進行瓊膠固體培養(yǎng)基的不通氣培養(yǎng)。,此過程反復多次，直至得到完全分離的純藻種群為止。 此法稀釋要使用較多容器分組培養(yǎng)，比較麻煩，但較易成功,* 3微吸管法： 選直徑5mm的細玻璃管在酒精噴燈上拉成極細的微吸管（口徑0.0080.16mm），將稀釋的藻液置于

6、凹玻片上（或將水樣在載玻片上滴成綠豆粒大小的一些水滴，這樣可使每個水滴中有很少生物而便于分離），在解剖鏡下用微吸管吸出所需要的藻種放入另一凹玻片上（用蒸餾水或平衡礦物質溶液沖洗數(shù)次），鏡檢這滴水中是否達到純的要求，如不純要反復數(shù)次，直至達到分離的目的為止，然后移入滅菌的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)（先導入有培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待生長旺盛后，再擴大培養(yǎng)）。 此種方法適合于大型藻類和浮游動物。 技術操作要求高，細心，吸取一個細胞要反復幾次才能成功。,4趨向反應法：利用藻類的特殊趨向性（如向光、向地等）不同而分離藻體。此過程反復幾次就可得到一定純度的藻體。分離效果較好，只是不能應用于不運動的藻體。,*5平板

7、分離法： 平板培養(yǎng)基的制備 A選擇恰當?shù)臒o機培養(yǎng)液，加入 1瓊脂（剪成細條）放在培養(yǎng)液中浸泡 B. 加熱融化，攪拌，并且補充蒸發(fā)掉的水分 C分裝：冷卻后分裝在培養(yǎng)皿中，約0.30.5cm 厚 D滅菌：高壓蒸氣滅菌，間歇蒸氣滅菌, 接種：用滅菌淡水稀釋水樣至適宜的濃度，裝入消毒過的小型噴霧器中，噴于培養(yǎng)基上，形成均勻分布的一層小水珠（或用接種環(huán)），蓋上培養(yǎng)皿的蓋子，在適宜的光照條件下培養(yǎng) 10 天左右，鏡檢各群落，找出純藻群落，用消毒玻璃針取出，移入培養(yǎng)液中，如果未達到目的，需反復進行。 步驟：無機培養(yǎng)液 l瓊脂加熱融化、攪拌冷卻分裝消毒接種培養(yǎng)。,6固氮藍藻分離培養(yǎng)法：將一小片藻絲群接種到培養(yǎng)

8、基上，幾天后再用滅菌白金絲挑取生出的新藻絲接種到平板培養(yǎng)基上。這樣經(jīng)幾次分離接種就得到較純的藻種。,* 7水滴分離法 用微吸管吸取稀釋適度的藻液，滴到消毒過的載玻片上，水滴盡可能小，能在鏡下（低倍）看到整個視野的全部水滴或大部分，一個載玻片上放 24 滴，作直線排列，水滴間要有一定的距，如果一滴水內有 1至幾個所需要的同種藻細胞，并無其它生物混雜，即用微吸管吸取培養(yǎng)液把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過消毒滅菌的試管或小三角燒瓶中不成功要反復做 此法簡便，易操作，適宜分離優(yōu)勢種類,三、藻種培養(yǎng),1、容器消毒：100, 200, 300, 500,1000, 1500ml三角燒瓶 2、工具（微吸管、接種

9、環(huán)、載玻片等）和培養(yǎng)液消毒 3、培養(yǎng)液置于容器中加入藻種，并用消毒紙包扎瓶口 4、在適宜光照下進行培養(yǎng)，每天搖動二次 5、鏡檢：觀察有否異常情況，是否受敵害生物侵襲 6、移養(yǎng)：經(jīng)過一個星期培養(yǎng)，可進行移養(yǎng),四、藻種的保存,1 意義：在一定時間內供接種用，免去重復分離，保持純種可以節(jié)省時間 2 方法 （瓊脂斜面保存） (l）制備固體培養(yǎng)基 容器： 500ml三角燒瓶、克氏扁瓶、試管 消毒：化學或物理方法 營養(yǎng)液的濃度：比正常高出1倍，加入瓊脂1 1.5% ，加熱融化，冷卻 分裝：將制備好的固體倍養(yǎng)基分裝于容器中，試管裝1/4制成斜面，三角燒瓶、克氏扁瓶裝量厚度為0.50.8cm ，冷卻在水平桌上

10、 滅菌、消毒：在制成斜面或平面以前進行,（2）接種：接種于冷卻的固體培養(yǎng)基上。接種后用消毒紙封口，接種后再在固體培養(yǎng)基上加培養(yǎng)液，以防止干燥。 （3）培養(yǎng)：置于弱光下培養(yǎng)，使其慢慢生長，長到一定密度，放入 5 的冰箱中，可保存一年：如果每天接受短弱的光照（幾小時）可保存 23 年；在完全黑暗的條件下，保存時間大大縮短。,藻種保存的其他方法,液 氮 保 存 固定化保存 液 體 保 存 減少接種量 加大氮素濃度 液體低溫保存,五、復習題：,1選種和育種具有什么意義？ 2選擇育種有哪幾種方法？ 3闡述藻種分離的方法及其特點？為什么要進行藻種分離？ 4如何進行藻種培養(yǎng)？ 5闡述保存藻種的操作過程？藻種

11、的保存應注意哪些方面的問題？ 6如何制備固體培養(yǎng)基？,附：分析技術 1細胞計數(shù)顯微鏡法 培養(yǎng)物中的個體數(shù)測定，是按照個體計數(shù)方法，測定和估計培養(yǎng)物單位容積中的個體數(shù)。計數(shù)方法同浮游植物定量的方法。此外，也可以采用血球計數(shù)法。 2分光光度計法： 培養(yǎng)物的藻類密度也可用分光光度計測定。當藻類密度較低時，光徑中的細胞數(shù)與測量到的光密度有一簡單的幾何關系。在藻類密度不大時，光密度大，細胞數(shù)目就多，即可用測得的光密度值表示細胞數(shù)目。,3干重測定 測定干重的增加量是生產(chǎn)估測方法中的一個最直接的方法，其步驟如下： 取樣取有代表性的一小部分體積的藻液。取樣時要特別注意：a將培養(yǎng)物攪拌均勻b快速吸取樣品以免沉積

12、c足夠多的樣品 分離取出樣品后，用過濾膜過濾或用離心法把藻體與介質分開。細胞必須洗過以除去鹽分和其它污物，通常是用稀釋的培養(yǎng)液或緩沖液。海洋藻類不能用蒸餾水洗，以免質壁分離和細胞脹破。 干燥選擇對特定有機體最適的烘干溫度。a避免過熱b有好的重復性c對同一樣品烘1小時后，稱得統(tǒng)一重量。 測定結果的表示法所得干重測定值要以單位培養(yǎng)液體積的干重表示。室外的培養(yǎng)池則用單位照光面積的干重來表示。,附：一些已大量培養(yǎng)利用藻類的生態(tài)適應性,三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum隸屬于硅藻門。體長2628m。繁殖方法為平行分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH710，最適pH7.58.5；生存鹽

13、度992，最適鹽度2532；生長適溫525，最適溫度1020。新月菱形藻Nitzschia clostertum隸屬于硅藻門。1323m。繁殖方法為縱分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH710，最適pH7.58.5；生存鹽度1861.5，最適鹽度2532；生長適溫528，最適溫度：1520。牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri隸屬于硅藻門。（4.04.9）（5.58.4）m。繁殖方法為無性為二分裂，環(huán)境不良形成休眠孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH8.08.9；最適鹽度：1025；生長適溫530，最適溫度：2530。,纖細角毛藻Chaetoceros gracilis隸屬于硅藻門。574m

14、。繁殖方法為無性為二分裂也可有性生殖；環(huán)境不良形成休眠孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適鹽度1535；最適溫度2830。中肋骨條藻Skeletonema costatum隸屬于硅藻門。直徑67m。繁殖方法為無性二分裂，也可形成增大孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH7.58.5；最適鹽度2530；生長適溫832，最適溫度2025。亞心形扁藻Platymonas subcordiformis隸屬于綠藻門。(1116 )(79) 。繁殖方法為無性繁殖，動孢子，環(huán)境不良形成休眠孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH69，最適pH7.58.5；生存鹽度880，最適鹽度3040；生長適溫730，最適溫度2028。,鹽藻Dun

15、aliella sp. 隸屬于綠藻門。1216m，寬812m。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH79，最適pH7.08.5；最適鹽度6070；最適溫度2530。小球藻Chlorella spp. 隸屬于綠藻門。直徑35m。繁殖方法為細胞內原生質體分裂形成似親孢子，待細胞破裂后釋放。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH68；鹽度適宜范圍廣；生長適溫1036，最適溫度25左右。微綠球藻Nannocholris oculata隸屬于綠藻門。直徑24m。繁殖方法為二分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為最適pH7.58.5；生存鹽度436；生長適溫1036，最適溫度2530。,球等鞭金藻Isochrysis galbana隸屬于金藻門。56m寬24m。繁殖方法為無性二分裂環(huán)境不良形成內生孢子。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存鹽度1030；生長適溫1035，最適溫度2530。湛江等鞭金藻Isochrysis galbana隸屬于金藻門，（67）（56）m，繁殖方法為無性二分裂，環(huán)境不良形成膠群體。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存pH69最適pH7.58.5；生存鹽度935，最適鹽度2532；生長適溫935，最適溫度2532。綠色巴夫藻Isochrysis zhanjianggensis 隸屬于金藻門，64.84m，繁殖方法為縱分裂。培養(yǎng)的生態(tài)條件為生存鹽度580，最適鹽度1040；生長適溫1035，最適