1細胞培養(yǎng)技術(shù)

1、細胞培養(yǎng)技術(shù),藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 周立軍,參考書目,細胞培養(yǎng)，世界圖書出版公司，1996年 培養(yǎng)細胞學(xué)與細胞培養(yǎng)技術(shù) ，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004年,本次課內(nèi)容細胞培養(yǎng)的基本知識,一、緒論 培養(yǎng)法的種類、培養(yǎng)法的發(fā)展、細胞培養(yǎng)的常用術(shù)語、培養(yǎng)細胞的作用及意義、培養(yǎng)法的應(yīng)用 二、培養(yǎng)細胞的特征 培養(yǎng)細胞的生長方式和類型、 培養(yǎng)細胞的生長特點和生長增殖過程、 細胞培養(yǎng)的條件及影響因素,一、緒論,細胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細胞的最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。 即：從活體中取出小塊組織分離出細胞，在一定條件下進行培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。 涉及有細胞生物學(xué)、生物化學(xué)與分子生

2、物學(xué)、動物學(xué)與植物學(xué)、病原學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、生物工程學(xué)甚至光學(xué)、物理學(xué)等等學(xué)科。因其涉及面很廣所以已經(jīng)滲透到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域,細胞培養(yǎng)（cell culture,組織培養(yǎng)的概念,組織培養(yǎng)（tissue culture）： 其本意是指從體內(nèi)取出組織和細胞，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法,器官培養(yǎng)（Organ culture）： 指的是應(yīng)用和組織培養(yǎng)相似的條件，培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法，以上三個層次的培養(yǎng)，又可統(tǒng)稱之為體外培養(yǎng)（in vitro,培養(yǎng)法的種類,體外培養(yǎng) 細胞培

3、養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng),體 外 培 養(yǎng) 種 類,細胞培養(yǎng)可分為群體培養(yǎng)和克隆培養(yǎng)兩種。 群體培養(yǎng)（mass culture）：即將大量細胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長，形成均勻的單層細胞或單細胞懸液。 克隆培養(yǎng)（clone culture）：即將少數(shù)細胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠，經(jīng)過繁殖每一個細胞形成一個集落，稱為克隆,群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右,原代培養(yǎng)第4天，成纖維樣細胞散布于培養(yǎng)瓶底，個別集落形成，細胞圍繞中心漩渦狀排列100,原代培養(yǎng)第7天，多個集落形成并融合100,培養(yǎng)法的發(fā)展,組織培養(yǎng)法的發(fā)展經(jīng)歷近百年。 德國人Roux（1885）用溫生理鹽水體外培養(yǎng)雞胚組織并存

4、活數(shù)月被認為是組織培養(yǎng)的萌芽試驗。 1903年Jolly用蓋片懸滴培養(yǎng)法，培養(yǎng)蠑螈白細胞生活一個月，提示組織或細胞離體后，在人工培養(yǎng)條件下，仍能生存,發(fā)展簡史,培養(yǎng)法的發(fā)展,關(guān)于神經(jīng)軸突的結(jié)構(gòu)和形成有爭議。 哈里森（生理學(xué)家）首先解剖了蛙胚的原始脊髓節(jié)段在淋巴液中進行培養(yǎng)。 在顯微鏡下觀察到從神經(jīng)芽細胞延伸出神經(jīng)軸突的狀況。 建立起一套合理的無菌培養(yǎng)技術(shù) 哈里森懸滴培養(yǎng)法,發(fā)展簡史,哈里森懸滴培養(yǎng)法,將蛙胚原始脊髓節(jié)段，移到事先滴有從成體蛙淋巴囊吸取的新鮮淋巴的蓋玻片上， 淋巴很快凝固，使組織小塊固定在一定的位置上。 然后將蓋玻片倒置于一塊中央凹陷的厚載玻片上，蓋玻片的周緣用蠟封固。 蛙胚神經(jīng)

5、組織存活了數(shù)周體外培養(yǎng)組織和細胞的基本模式系統(tǒng),發(fā)展簡史,卡氏瓶的發(fā)明,Carrel用反復(fù)傳代的方法使細胞系存活34年。他采用的無菌技術(shù)，以及后來設(shè)計的培養(yǎng)瓶（卡氏瓶，Carrel flask）等都是對組織培養(yǎng)的重要貢獻。特別是他的連續(xù)培養(yǎng)，為后來的傳代培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ),發(fā)展簡史,組織培養(yǎng)發(fā)展示意圖,1923年，Carrel設(shè)計了卡式瓶培養(yǎng)法，擴大了組織的生存空間。 1924年Maximow的雙蓋片培養(yǎng)法，使之更易于傳代和減少污染,發(fā)展簡史,1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化處理和應(yīng)用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了的單層細胞培養(yǎng)，單層培養(yǎng)成了組織培養(yǎng)普遍應(yīng)用的技術(shù)。促進了細胞系(cell

6、line)的建立。 近年各種條件已商品化系列化，應(yīng)用冷凍技術(shù)，各國建立細胞庫,發(fā)展簡史,我國組織培養(yǎng)的發(fā)展,20世紀30年代傳入我國。 20世紀50年代起步。 20世紀70年代，成為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中應(yīng)用的手段,組織培養(yǎng)常用術(shù)語,原代培養(yǎng)（primary culture）：從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。 傳代培養(yǎng)（passage culture）：將細胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)。 注：傳代（passage，subculture,原代培養(yǎng),胎兒細胞培養(yǎng)比成人容易；成體組織中成纖維細胞、腎上皮細胞比較容易，上皮細胞培養(yǎng)難。 細胞間的分離酶：胰蛋白酶、膠原酶、

7、 單一種類細胞的分離培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)條件培養(yǎng)基、細胞接著面的條件、接著速度、離心法等,術(shù)語,細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)經(jīng)首次傳代成功后即成細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細胞世系所組成。 細胞株（cell strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的特殊性質(zhì)或標志，并能穩(wěn)定保持這些特性的培養(yǎng)物。 克隆（clone）：指單個細胞通過有絲分裂所產(chǎn)生的遺傳性狀相同的細胞群體,術(shù)語,有分化特性的細胞系和細胞株,對細胞培養(yǎng)技術(shù)的評價,優(yōu)點： 1、活細胞： 能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動； 2、可控制： 選擇對象：均一性、重復(fù)性（類型、性質(zhì)、階段）

8、； 調(diào)節(jié)條件：各種因素（物理、化學(xué)、生物等因素）； 利用方法：研究技術(shù)、記錄方法； 3、應(yīng)用廣： 領(lǐng)域多：醫(yī)學(xué)研究、生物技術(shù)、基因工程等 對象廣：各種動物（低等動物-高等動物-人類） 一種動物（不同年齡、不同組織） 正常或異常（腫瘤） 4、較經(jīng)濟： 可提供大量、同時、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的實驗對象,缺點： 1、培養(yǎng)細胞會發(fā)生改變； 2、對人員、設(shè)備等要求較高。 與體內(nèi)主要不同 相對孤立、相對單一、缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響。 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)、分化減弱、細胞趨向單一化。 提示 要正確認識體外培養(yǎng)細胞是一種特定條件下生長的細胞群體,對細胞培

9、養(yǎng)技術(shù)的評價,細胞培養(yǎng)技術(shù)的研究、觀察內(nèi)容,細胞內(nèi)活動：例如能量的代謝、DNA轉(zhuǎn)錄、凋亡及蛋白合成等。 細胞內(nèi)部與細胞外界之間的作用：如細胞對外界刺激的反應(yīng)、藥物對細胞的作用、細胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌等。 細胞間的相互作用：如形態(tài)發(fā)生、細胞間的粘著作用、接觸抑制、密度抑制等。 細胞內(nèi)的流動：如信號傳導(dǎo)、鈣離子的流動、RNA的移動、激素受體復(fù)合物的易位等。 遺傳學(xué)：如遺傳分析、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化等,細胞培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域,一）、在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用 （二）、在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用 （三）、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 （四）、在遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用 （五）、在藥理學(xué)研究中的應(yīng)用 （六）、在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用 （七）、在腫瘤

10、學(xué)研究中的應(yīng)用 （八）、在器官移植中的應(yīng)用,病毒檢驗方法,病毒學(xué),檢測病毒,雜交瘤技術(shù)Hybridomas,免疫學(xué),單克隆抗體制備,免疫學(xué),在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用,1、 體外培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)化 2、 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 3、基因診斷和基因治療,器官移植組織工程,種子細胞（干細胞） 支架材料,組織工程,二、培養(yǎng)細胞的基本特征,培養(yǎng)細胞的生長方式和類型 培養(yǎng)細胞的生長特點和生長增殖過程 細胞培養(yǎng)的條件及影響因素,一）培養(yǎng)細胞的生長方式和類型,粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才 能生長的細胞。 如：成纖維細胞、心肌與平滑肌細胞、表皮細胞、骨與軟骨細胞、腫瘤細胞 懸浮型細胞：不必附著于固相支持物表面，而

11、 在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。 如：血、脾及骨髓培養(yǎng)的細胞及某些癌細胞,粘附型（貼壁型）細胞,粘附:是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式 細胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征。 體外：細胞只有一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時 明顯不同,粘附型細胞,成纖維型細胞,上皮型細胞,游走型細胞,多形型細胞,成纖維型細胞,來源：中胚層間充質(zhì)組織起源的細胞，如：成纖維細胞、心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮細胞。 形態(tài)：類似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起，中央有卵圓形核。 生長特點：排列成放射狀，漩渦狀生長

12、,上皮型細胞,來源：起源于內(nèi)、外胚層的細胞，如：皮膚及其衍生物、消化道、乳腺、肺泡、上皮性腫瘤等。 形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞，呈扁平、不規(guī)則、多角形，中有圓形核。 生長特點：細胞緊密相連成單層膜 相靠緊密相連成薄層鋪石狀,培養(yǎng)細胞的形態(tài)不穩(wěn)定，可因各種因素而發(fā)生改變，如pH、細胞密度、污染等因素。 HeLa細胞： 血清 高血清成纖維樣細胞 低血清上皮樣細胞 pH 標準pH上皮樣細胞 太酸或太堿成纖維樣細胞 細胞密度 低密度成纖維樣細胞 高密度上皮樣細胞 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化成纖維樣細胞 轉(zhuǎn)化后上皮樣細胞,粘附型細胞,懸浮型細胞,概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生

13、長。 來源：取自血液、脾或骨髓，尤以血中白細胞腫瘤細胞為主。 特點：在懸浮中生長良好，細胞圓形，呈單個或小細胞團,優(yōu)點： 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點： 觀察不方便 很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞,懸浮型細胞,培養(yǎng)細胞的生長特點,粘附并伸展 是大多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。細胞在接種后很快便可見到細胞伸出偽足附著，與支持物形成一些接觸點，接著細胞逐漸呈扁平或放射狀伸展，逐漸形成上皮型或成纖維型或其他類型生長。 密度依賴性 細胞接種密度過高或過低都會影響細胞的生長、增殖。當細胞粘附生長、融合成單層時，細胞變得較為擁擠，而扁平形狀的程度減少，

14、與培養(yǎng)基的接觸面減少，同時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物逐漸消耗，細胞分裂減弱，增殖減慢,二、培養(yǎng)細胞的生長增殖過程,單個細胞的細胞周期（cell cycle） 細胞系的生長過程 培養(yǎng)細胞傳代的生存期,單個細胞的細胞周期（cell cycle,生長增殖過程,組織培養(yǎng)細胞生命期,原代培養(yǎng)期 傳 代 期 衰 退 期,原代培養(yǎng)期,又稱初代培養(yǎng)期 （primary culture），從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。 此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛；細胞形態(tài)相似。 細胞群是異質(zhì)的，也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強,傳代培養(yǎng)期 初代培養(yǎng)期一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系ce

15、ll line。 此期為三期中最長，可維持二倍體核型（二倍 體細胞系）。 當傳代3050代后，細胞增殖逐漸緩慢，以致 完全停止。 衰退期 細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài) 輪廓增強，最后衰退凋亡,體外培養(yǎng)細胞一代增殖生長過程,第3代BMSCs的分裂指數(shù)曲線,接觸抑制（contact inhibition）：貼壁生長的體外正常細胞一旦匯合、相互接觸后便停止了分裂增殖，不再進入S期，也不會出現(xiàn)交叉重疊生長。 惡性細胞無接觸抑制現(xiàn)象，所以可將其作為區(qū)別正常細胞與癌細胞的標志之一。 密度抑制（density inhibition）：培養(yǎng)液營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物

16、的影響，發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止,培養(yǎng)細胞生長過程中的特點,傳代細胞可連續(xù)傳710代，細胞形狀基本相同，但隨著傳代次數(shù)增多，細胞逐漸呈老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為:細胞增殖速度明顯減慢，胞漿中出現(xiàn)空泡及顆粒樣物質(zhì)，細胞碎片增多，細胞形態(tài)變?yōu)楸馄?，失去貼壁能力，從培養(yǎng)瓶底脫落,三、細胞培養(yǎng)的條件,水高度純化 糖葡萄糖 氨基酸12種 維生素 無機離子和微量元素 促生長因子,各種培養(yǎng)基,血 清,血清的種類 血清的主要成分及主要作用 血清的使用與儲存 影響血清的各種因素 細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點,1、血清的種類 胎牛血清：剖腹產(chǎn)的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之內(nèi)的新生牛 小牛血清：出生1030d的小

17、牛 （人血清、馬血清、羊血清） 2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血漿去除纖維蛋白而形成，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質(zhì)對促進細胞生長活性是達到生理平衡的,血清的主要作用,提供基本營養(yǎng)物質(zhì) 提供貼壁和擴展因子（FN、LN） 提供激素及各種生長因子 （FGF、EGF、PDGF) 提供結(jié)合蛋白（中和代謝產(chǎn)物及蛋白分解酶等細胞障礙因素） 對培養(yǎng)中的細胞提供某些保護作用注意點： 血清型號、種類不同，所含營養(yǎng)因素有差別，不可忽視； 在需要觀察細胞某種特性時，血清使問題變復(fù)雜，要除去,血清的使用與儲存,使用前的處理 56滅活30min 去除補體成分

18、（趨勢：大部分細胞培養(yǎng)不需滅活； 需要滅活的：巨噬細胞、肥大細胞、血小板、淋巴細胞等） 儲存條件 滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），20 儲存；使用前4 融化。 使用濃度 一般為520，最常用的是10,影響血清的各種因素,年齡：較老動物的血清對細胞生長有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清對細胞生長有利 血色素 膽紅質(zhì) 脂肪酸 血清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好,細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點,使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。 如：血清可以促進成纖維細胞的生長，同時會抑制表皮角質(zhì)細胞的生長。 血清中含有一些物質(zhì)對細胞會產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶 每批血清之間都有

19、差別，其成分不能保持一致。 取材過程中有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)細胞產(chǎn)生影響,影響細胞生長的因素,溫度 滲透壓 氣體環(huán)境和pH 無毒和有毒 輻射線和超聲波 細胞接種密度 容器轉(zhuǎn)動速度和懸浮攪動速度,溫 度,一般哺乳類及禽類細胞體外培養(yǎng)的適宜溫度3738，溫度過高或過低都會影響到細胞的生長,溫度對細胞生長的影響,低 溫,在低溫下，細胞的代謝活力及核分裂降低。 溫度不低于0 時，雖影響細胞代謝，但并無傷害作用；再把細胞置于2535 時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢。 若溫度過低，在降到冰點以下時，細胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡。 若向培養(yǎng)液中加入甘油或二甲基亞砜等，封入凍存管，置于液氮中，

20、細胞可耐受70 以下溫度，能長期儲存，解凍后細胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)生長增殖，生物性狀不受影響,高 溫,細胞在40數(shù)小時后，再置回37 培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長；但如果在40 下暴露時間太長，對細胞生長不利，甚至變圓脫離瓶底。 細胞在3940 培養(yǎng)1h，能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)，但不能忍受溫度再升高2 ，持續(xù)數(shù)小時，即在4142 中培養(yǎng)1h，細胞損傷嚴重，溫度至43 以上時細胞多數(shù)被殺死。 高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞、核分裂的破壞，產(chǎn)生凝固酶使細胞發(fā)生凝固，另外使蛋白質(zhì)變性,氣體環(huán)境和pH,氧（O2） 參加細胞的三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量以供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。 采用開放式培養(yǎng)時

21、（碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)），一般要把細胞置于95空氣加5二氧化碳的混合氣體環(huán)境中,二氧化碳（CO2,CO2既是細胞的代謝產(chǎn)物，又是細胞生長所必需的成分，并與維持培養(yǎng)液的pH有關(guān)。 大多數(shù)細胞適于在pH 7.27.4條件下生長，低于pH 6.8或高于pH 7.6對細胞有害，甚至造成細胞退化或死亡。 細胞對堿性不如對酸性的變化耐受，偏酸的條件比偏堿的環(huán)境對細胞生長有利。 隨細胞數(shù)量的增多、代謝加強，釋放CO2增多，使pH 降低。為了維持培養(yǎng)基恒定的pH ，多在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑。 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：對細胞無毒性，也不起緩沖作用，主要作用是防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的pH值,無污染及無毒,直接或間接接觸的器皿、材料 污染：細菌等微生物、細胞間、有害物質(zhì),本章小結(jié),培養(yǎng)細胞的生長方式和類型 培養(yǎng)細胞的生長特點和生長增殖過程 細胞培養(yǎng)的條件及影響因素,細胞培養(yǎng)室的設(shè) 置、設(shè)備和準備工作,一、細胞培養(yǎng)的必備設(shè)施,無菌實驗室 超凈工作臺 恒溫培養(yǎng)箱 其他設(shè)備 （電熱干燥箱、冰箱、