感受態(tài)細(xì)胞的制備與連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株

1、Q V0：未酶切的質(zhì)粒; V1：酶切不完全的質(zhì)粒; V1:完全酶切的質(zhì)粒; M:分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000,我們的結(jié)果,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳（1%） Lane14：雙酶切的PCR產(chǎn)物L(fēng)ane69：雙酶切的質(zhì)粒lane 5： 未酶切的質(zhì)粒Lane 10: 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000,1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G H M,酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳（1%） Lane17：雙酶切的PCR產(chǎn)物L(fēng)aneBH：雙酶切的質(zhì)粒lane A： 未酶切的質(zhì)粒Lane M: 分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000,真不錯(cuò),我們的結(jié)果,4組,5組的PCR酶切,DL15000

2、分子量分布（bp）：15000，10000，7500，5000，2500，1000，250,6組,3組,我們的結(jié)果,5組的質(zhì)粒酶切,7組的質(zhì)粒酶切酶切,沒(méi)有切開？還是電泳行為異常？需要鑒定,Q&A,關(guān)于酶切產(chǎn)物的回收 膠回收：更純，相對(duì)回收率低； 液體直接回收：相對(duì)回收率高。 酶的量：酶的星號(hào)活力,感受態(tài)細(xì)胞的制備 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株,基因的克隆與表達(dá)專題之四,pETBlue System： 藍(lán)白篩選：其具有的大腸桿菌tet啟動(dòng)子是弱的組成型啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng) 下游LacZ -片段表達(dá)實(shí)現(xiàn)藍(lán)白篩選； 高效可誘導(dǎo)表達(dá)：高效表達(dá)外源蛋白。pETblue系統(tǒng)可選用NovaBlue (CE6,在PL啟動(dòng)子

3、的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)T7RNA聚合酶的噬菌體)或TunerTM(DE3)pLacI菌株做宿主菌。這些宿主的基因組上帶有l(wèi)acUV5啟動(dòng)子控制的 T7RNA聚合酶基因，可以實(shí)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)。 低本底表達(dá)：由于T7-lac啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因的表達(dá)方向與tet啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的LacZ -片段表達(dá)的方向相反，所以此系統(tǒng)基本沒(méi)有外源基因的本底表達(dá),Inductive Expression - Introduction,大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、酵母、植物 實(shí)驗(yàn)中，要根據(jù)所要表達(dá)的蛋白質(zhì)的大小、蛋白質(zhì)的需要量、是否需要活性以及實(shí)驗(yàn)室的條件等綜合考慮選擇合適的宿主-載體系統(tǒng) 大腸桿菌遺傳圖譜明確，容

4、易培養(yǎng)，費(fèi)用低，已有許多成功的先例，是首選的表達(dá)系統(tǒng)，但大腸桿菌中缺少翻譯后修飾系統(tǒng)，一些修飾后才有活性的蛋白必需選擇真核細(xì)胞為宿主 分離基因 構(gòu)建重組載體 轉(zhuǎn)化 篩選鑒定 表達(dá)與優(yōu)化表達(dá)條件,Inductive Expression - Introduction,表達(dá)宿主系統(tǒng),TunerTM菌株是BL21的lacZY缺失突變株，能夠同時(shí)調(diào)整同一培養(yǎng)體系中所有細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平。lac通透酶（lacY）突變使得IPTG均勻進(jìn)入群體所有細(xì)胞，從而獲得濃度依賴的、水平均一的誘導(dǎo)。通過(guò)改變IPTG濃度，表達(dá)可從極低水平調(diào)節(jié)到極強(qiáng)的、完全誘導(dǎo)的表達(dá)水平（通常與所使用的pET載體相關(guān)）。低水平表達(dá)可以增

5、強(qiáng)難表達(dá)蛋白的溶解性和活性。Tuner（DE3）pLacI菌株可與pETBlue和pTriExTM載體的配合使用,NovaBlue是一種適合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株，具有高轉(zhuǎn)化效率、藍(lán)/白斑篩選能力（與相應(yīng)的質(zhì)粒配合使用）和促進(jìn)質(zhì)粒DNA高產(chǎn)的recA endA突變。由于存在F附加體編碼的lacIq阻遏蛋白，NovaBlue的DE3溶原菌是一個(gè)非常有用的嚴(yán)緊型宿主菌,BL21是應(yīng)用最廣的宿主菌來(lái)源，具有l(wèi)on和ompT蛋白酶缺陷的優(yōu)點(diǎn) . （DE3）宿主菌是lDE3溶原菌，染色體上帶有一拷貝由lacUV5啟動(dòng)子控制的T7 RNA聚合酶基因。這類菌株配合pET載體一起表達(dá)。pLysS是帶

6、有可以與pET共存的、編碼T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的質(zhì)粒。 pLysS 菌株在被誘導(dǎo)前T7 RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)被抑制，這樣可以使表達(dá)會(huì)影響宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的重組體在宿主中更穩(wěn)定。帶有pLacI質(zhì)粒的宿主菌產(chǎn)生額外的抑制pETBlue和pTriEx載體基礎(chǔ)表達(dá)的lac阻遏蛋白,Inductive Expression - Introduction,LacI,pETBlue,大腸桿菌基因組,Lac啟動(dòng)子,T7啟動(dòng)子,IPTG誘導(dǎo),IPTG誘導(dǎo),大腸桿菌 RNA聚合酶,T7 RNA聚合酶基因1,T7RNA聚合酶,T7RNA聚合酶,靶基因,pETBlue系統(tǒng)調(diào)控元件,LacI

7、,Lac阻遏物,Lac阻遏物,DE3,LacO,LacO,pLacI,TunerTMDE3LacI,Inductive Expression - Introduction,X-gal：5-溴-4-氫-3-吲哚-D半乳糖苷,制備感受態(tài)細(xì)胞,預(yù) 培 養(yǎng):(昨天下午,LB培養(yǎng)基（4mL，含12.5g/mL Tet）37 、190rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,擴(kuò) 大 培 養(yǎng):(今天早晨,0.4mL預(yù)培養(yǎng)菌液 40mL LB液體培養(yǎng)基（含12.5g/mL Tet） 37 、250rpm振蕩培養(yǎng)2.5-3小時(shí),收集細(xì)胞,終止培養(yǎng)（OD600 0.4-0.5 ）轉(zhuǎn)移菌液到50mL離心管中，冰浴10min 離心（4，

8、4000rpm 10min ）！ 棄液: 倒出培養(yǎng)液，將管倒置使培養(yǎng)液流盡,制備感受態(tài),穿孔：加入預(yù)冷的CaCl2（ 0.1 mol/L，10mL） 輕柔吹懸菌體細(xì)胞（用5 mL槍頭） 冰浴 30min收集：離心(4，4000rpm 5min)，充分棄上清 保存：預(yù)冷的CaCl2 （0.1 mol/L， 2mL） 冰上輕柔吹懸菌體細(xì)胞 分裝保存：200uL/份（ -20 短期或-70 稍長(zhǎng)期凍存,感受態(tài),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株,1、樣品制備 用槍頭輕柔混勻，冰上放置30min,對(duì)照的作用,注意：無(wú)菌！輕柔！冰浴,2、轉(zhuǎn)化 42 水浴熱激90秒 冰浴2分鐘 3、復(fù)蘇 每管加800L LB液體培養(yǎng)基

9、 37 慢搖1小時(shí)（150rpm ） （這段時(shí)間鋪平板） 4、選擇性篩選 濃縮菌液：離心（4000rpm 1min） 吸棄900uL上清，吹懸剩余細(xì)胞 涂 板： 取50uL細(xì)胞懸液，涂布在選擇平板上， 倒置培養(yǎng)過(guò)夜（37,復(fù)蘇目的,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,陰性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)平板,儀器使用與注意事項(xiàng),離心前，一定要在超凈臺(tái)中絕對(duì)平衡,配制液體并高壓,LB液體培養(yǎng)基 140mL 胰蛋白胨（tryptone) 1.4g 酵母提取物（yeast extract) 0.7g NaCl 1.4g140mL水溶解， 5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值(約28L) 分裝：250mL錐形瓶， 40mL/瓶2瓶 15ml大試管， 4 mL/管14管,配制液體并高壓,2. LB固體培養(yǎng)基(含1.2瓊脂) 200 mL LB液體培養(yǎng)基 200 mL 瓊脂粉 2.4 g 濕熱高溫滅菌，待溫度降到60左右 加入： Carb (50g/mL)、Tet (12.5g/mL) X-gal (70 g/mL)、IPTG(80mol/L) 混勻后立即鋪平板10塊（約20mL/板,不用溶解 不要掛壁,均為終濃度,下次實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)介與準(zhǔn)備,質(zhì)粒的提取 重組質(zhì)粒的酶