蛋白質的提取

1、第四章 生物化學與分子生物學技術實踐,第一節(jié) 生物成分的分離與測定技術,蛋白質的分離與純化,蛋白質的性質 蛋白質分離和純化 蛋白質的分離步驟 蛋白質的純化方法 蛋白質含量的測定 蛋白質純度等的測定,蛋白質存在于生物體的組織細胞中，不同的生物體組織細胞所含的蛋白質種類、數(shù)量也不盡相同,一、蛋白質的性質,蛋白質與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。 在不同的pH環(huán)境下，蛋白質的電學性質不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質電泳,1 、蛋白

2、質的兩性離解和電泳現(xiàn)象,由于蛋白質的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。 由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去,2 、蛋白質的膠體性質,蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。 改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質 在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來,3 、蛋白質的沉淀作用,在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。 在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀

3、。 可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等,可逆沉淀,在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產(chǎn)生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。 如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀,不可逆沉淀,蛋白質的性質與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素，能夠破壞蛋白質的結構狀態(tài)，引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質的變性,4 、蛋白質的變性,蛋白質的變性,變性蛋白質通常都是固體狀態(tài)物質，不溶于水和其它溶劑，

4、也不可能恢復原有蛋白質所具有的性質。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等,大部分蛋白質均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質在280nm 附近顯示強的吸收。 利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑒定,5 、蛋白質的紫外吸收,要研究某種蛋白質的結構、性質和功能，就必須將這種蛋白質從組織細胞中分離、純化出來。因此，蛋白質的分離與純化技術便成為蛋白質研究的重要技術,二、蛋白質分離和純化,研究蛋白質的結構、性質和功能，首先需要得到純的蛋白質樣品。 (1)蛋白質來源：微生物細

5、胞、動物細胞和植物細胞； (2)隨時測定蛋白質活性并檢測蛋白質含量。 (3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進行,1)生物組織的機械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法和酶解法等。 (2)根據(jù)蛋白質的特性，選擇不同的溶劑進行抽提。 水溶性蛋白用中性緩沖溶液（透析液）抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用有機溶劑抽提等。 (3)粗提: 離心除去固體雜質后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質粗制品。 (4)提純：可用層析法、電泳法等進行提純。 (5)成品加工：測定蛋白質的性質并干燥成成品,1蛋白質的分離步驟,血紅蛋白提取和分離步驟,具體操作,步驟,一,二,三,四,血 液,血 漿,

6、水 分,固體物質,血漿蛋白,無機鹽 磷 脂 葡萄糖等,血細胞,白細胞,血小板,紅細胞 （最多,血紅蛋白 （,90,血液組成成分,1.洗滌紅細胞,1.1 洗滌的目的：洗去血液中血漿及血小板等中的雜蛋白 1.2 洗滌過程,血液 100mL,重復洗滌3次，直至上清液沒有,一）樣品處理,黃色,2. 血紅蛋白的釋放,原理：紅細胞滲透作用吸水漲破，釋放血紅蛋白,3.分離血紅蛋白溶液,分離過程,紅細胞 混合液,離心管,透析的目的是什么,去除血紅蛋白中的小分子雜質,二）粗分離透析血紅蛋白,注意事項,1）生理鹽水作用,3）兩次離心的差異,4）透析袋的作用機理,模擬紅細胞生存環(huán)境，保持紅細胞結構完整,破碎紅細胞；

7、溶解細胞膜 釋放血紅蛋白,前慢后快，前短后長,滲透作用,2）蒸餾水和甲苯的作用,離心沉降法 凝膠色譜法 萃取法 層析法 電泳法,三）純化,1.凝膠色譜法,1）原理： （2）材料：凝膠,大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快； 小分子穿過多孔凝膠顆粒的內部，路程長，流動慢,凝膠是微小的多孔性球體，如葡聚糖或瓊脂糖。內部有許多貫穿的通道,根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的方法,概念,凝膠色譜法純化蛋白質,1）原理,不同蛋白質的帶電性質（正電荷或負電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同,電泳：帶電粒子在電場的作用下

8、發(fā)生遷移的過程,四）純度鑒定電泳,2）電泳結果分析 如果出現(xiàn)一個條帶：樣品中含有一個分子質量級別多肽； 如果出現(xiàn)兩個條帶：樣品中含有兩個分子質量級別多肽,由弱酸和相應的強堿弱酸鹽溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,3）緩沖溶液洗脫劑 作用： 配制,調節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液,抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定,思考：如何配制不同PH值不同的緩沖液,實驗四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳,目的要求】 1、掌握電泳技術的一般原理和基本操作過程。 2、熟悉血清中蛋白分類以及電泳分離操作,實驗原理,1.電泳：是指帶電粒子在電場中向本身所帶電荷相

9、反的電極移動的現(xiàn)象。 在一定pH條件下，不同的蛋白質由于具有不同的等電點而帶不同性質的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，它們的電泳遷移率不同,V=EQ/(6r,M=V/E=Q/(6r,V：電泳速度 M：遷移率 E：電場強度 Q：顆粒帶電荷量 r：球形分子半徑 ：介質粘度,實驗原理,2. 影響電泳的因素： 內在因素：蛋白所帶凈電荷的量、蛋白的大小和形狀 外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象,影響蛋白質分子運動速度的因素,3.醋酸纖維素溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結構，

10、厚度約為120m，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點,血清蛋白參考值,4. 經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質的百分含量,實驗器材,1. DYY-6C型 雙穩(wěn)定時電泳儀和DYY-型電泳槽 2.醋酸纖維薄膜（2 cm8cm）：1片/人。 3.培養(yǎng)皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.點樣器：載玻片。 5.濾紙：公用。 6.鑷子：一個/組,實驗試劑,1、巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，0.07 m

11、ol/L，離子強度0.06) 2、0.5% 氨基黑10B染色液 3、漂洗液,1.浸泡 將28 cm醋酸纖維薄膜置于電泳緩沖液中，浸泡15 min左右，至完全浸透，方可用于點樣,實驗操作,2.點樣 用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內吸干多余的緩沖液，迎光判斷光面與無光澤面。用邊緣整齊的玻片沾取少量無溶血血清，垂直按壓于醋纖膜標號一端約1.5-2處(約23l,3.電 泳 將點樣端的薄膜平貼在陰極濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極濾紙橋上(見下圖)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。 平衡片刻(2-3min)；使其自然充滿緩沖液；而后電壓120V，電流0.40.6mA/，通電45分鐘

12、,4.染色： 電泳完畢后將薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡3-5 min,5.漂洗： 將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次(3-4次)，直至條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜,6. 記錄和分析實驗結果漂洗完畢后將薄膜取出, 放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄在預習本上，并判斷分析其結果,注意事項,1、點樣前，應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。 2、薄膜的浸潤與選擇正確膜面是電泳成敗的關鍵之一。 3、點樣應點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。 4. 手盡量不要觸及薄膜，用鑷子夾取。 5、

13、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜 片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。垂直點樣。 6、電泳時應將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且點樣面向下。 7、電泳開始后，不能再取放薄膜，以防觸電。如必需進行，要先關閉電源。 8、應控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進行復染,思考題,電泳圖譜清晰的關鍵是什么？如何正確操作,本堂小結,本節(jié)內容目標：血紅蛋白的分離和純化,獲 取 紅細胞 （離心,破碎紅細胞，釋放血紅蛋白,從各紅細胞的成分中獲取血紅蛋白 （離心,初步純化血紅蛋白（透析,從生物材料中提取某些特定成分,背景知識,早在古代，人類就

14、已發(fā)現(xiàn)芳香氣味的植株或花卉能使人神清氣爽，將這些植物制成干品后，可當做藥物和香料使用。但是，植物香料易揮發(fā)，不易儲存。歐洲中世紀香料貿易的發(fā)展，促成了植物芳香油提取技術的誕生,16世紀，制備植物芳香油的技術已相當成熟。19世紀，有機化學迅速發(fā)展，人們通過分析植物芳香油的化學成分，找到了芳香的根源，進而合成了人造香料。如今，植物芳香油廣泛地應用于輕工、化妝品、飲料和食品制造的方面,基礎知識,動物,植物,微生物,主要來源于麝、靈貓、海貍和抹香鯨等,天然香料的來源,根、莖、葉、花、果實、種子,真菌,植物芳香油的物理性質,植物芳香油的化學本質,具有很強的揮發(fā)性,主要包括萜類化合物及其衍生物,植物芳香油

15、的提取方法,植物芳香油選擇方法的依據(jù),根據(jù)植物原料的特點來決定,蒸餾、 壓榨 、 萃取,提取植物芳香油的常用方法,提取植物芳香油常用方法的原理,水蒸氣蒸餾法 ： 水中蒸餾法、水上蒸餾法、水氣蒸餾法,利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，冷卻后，油水混合物又重新分出油層和水層,水中蒸餾適于某些鮮花、破碎果皮和不易粘結的原料。但水中蒸餾精油中的酯類成分易水解，所以含酯類高的香料植物不能采用這種方法,1. 水中蒸餾,又稱隔水蒸餾，是把原料置于蒸餾鍋內的篩板上，篩板下盛放一定水量以滿足蒸餾操作所需的足夠的飽和蒸汽，水層高度以水沸騰時不濺濕原料底層為原則,2. 水上蒸餾,水上蒸餾應

16、用較廣，大面積種植的芳香植物為薄荷、香茅、桉樹葉等都用水上蒸餾提取精油；此法也適用于粉碎后的干燥原料包括某些干花,是由外來的鍋爐蒸汽直接進行蒸餾。通常在篩板下鍋底部位裝有一條開小孔的環(huán)形管，鍋爐來的蒸汽通過小孔直接噴出。通過篩板的篩孔進入原料層加熱原料。由鍋爐來的蒸汽是具有一定蒸汽壓力，溫度較高而含濕量又較低的飽和蒸汽，能很快加熱料層，因此，對干料加熱蒸餾時，干料必須在裝鍋前預先濕透。直接蒸汽蒸餾，其蒸餾速度快，溫度高，可縮短蒸餾時間，高沸點的成分可蒸出，出油率高,3. 直接蒸汽蒸餾,因為水中蒸餾會導致原料焦糊和有效成分水解等問題,原因,提取柑橘芳香油的方法,通常用壓榨法,萃取法的原理,將粉碎

17、、干燥的植物原料用有機溶劑浸泡，使芳香油溶解在有機溶劑中的方法。芳香油溶解于有機溶劑后，只需蒸發(fā)出有機溶劑，就可以獲得純凈的植物芳香油了,利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的植物芳香油攜帶出來,使芳香油溶解在有機溶劑中，蒸發(fā)后得到芳香油,通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油,水蒸汽蒸餾 分離油層 除水過濾,粉碎、干燥 萃取、過濾 濃縮,石灰水浸泡、漂洗 壓榨過濾靜置 再次過濾,提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性強的芳香油,原料顆粒盡可能細小，能充分浸泡在有機溶劑中,適用于柑橘、檸檬等易焦糊原料的提取,植物芳香油提取三種方法的比較,1、提取方法,水蒸氣蒸餾法,一、玫瑰精油的提取,實驗設計,2、實驗設計玫瑰精油的提取裝

18、置,3、實驗步驟,采集玫瑰花：采集盛花期（5月上中旬） 的玫瑰花，清水清洗瀝干。 裝入蒸餾原料：稱取50g玫瑰花放入蒸餾瓶，添加200mL蒸餾水,安裝蒸餾裝置：所有儀器必須事先干燥，保證無水,加熱蒸餾,拆卸蒸餾裝置： 分離油層,蒸餾完畢，應先撤出熱源，然后停止通水，最后拆卸蒸餾裝置，拆卸的順序與安裝時相反,收集錐形瓶中的乳濁液，向錐形瓶中加入質量濃度為0.1 gmL的NaCl，然后將其倒入分液漏斗中，用分液漏斗將油層和水完全分開。放出玫瑰精油，用接收瓶收集,除去水分,向接收瓶加入無水Na2S04，24h后過濾，得到玫瑰油,注意事項：蒸餾時間不能過短，溫度不能過高,鮮玫瑰花+清水,水蒸氣蒸餾,油水混合物,油水分離,除水,玫瑰油,加無水Na2SO4,加NaCl,氯化鈉：促使油水混合物（乳濁液中油和水