淮師大細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)室安全守則一般規(guī)定 1、上課第一天請先熟悉環(huán)境，察看緊急沖洗站、洗眼站、滅火器、急救箱及安全梯等的位置，牢記“安全”是進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)最重要的準(zhǔn)則。 2、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)請穿著實(shí)驗(yàn)服，避免穿涼鞋、拖鞋。留有長發(fā)者，戴帽套將頭發(fā)捲入套內(nèi)，或以橡皮筋束于后，以防止引火危險或污染實(shí)驗(yàn)。 3、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止吸煙、飲食、化妝、嚼口香糖、嬉戲奔跑，食物飲料勿存放于實(shí)驗(yàn)室的冰箱中，實(shí)驗(yàn)桌上勿堆放書包、書籍、衣服及雜物等。 4、所有實(shí)驗(yàn)儀器、耗材、藥品等均屬實(shí)驗(yàn)室所有，不得帶出實(shí)驗(yàn)室。每組分配的儀器、耗材請確定清點(diǎn)與保管，課程結(jié)束后如數(shù)清點(diǎn)繳回。公用儀器請善加愛惜使用，實(shí)驗(yàn)前后，請把工作區(qū)域清理擦拭，并隨時保持環(huán)境

2、衛(wèi)生。 5、實(shí)驗(yàn)前詳閱實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的原理及操作規(guī)程，注意上課所告知的注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中有任何狀況或疑問，隨時發(fā)問，切勿私自變更實(shí)驗(yàn)程序。打翻任何藥品試劑及器皿時，請隨即清理。實(shí)驗(yàn)后，確切記下自己的結(jié)果，嚴(yán)禁抄襲，確定關(guān)閉不用的電源、水、酒精燈及煤氣等。 6、睡眠不足、精神不濟(jì)或注意力無法集中，請立即停止實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時間若延長，請注意時間的管制及自身的安全，不可自行逗留實(shí)驗(yàn)室過夜。 7、實(shí)驗(yàn)完畢，請清理實(shí)驗(yàn)室、倒垃圾、滅菌、關(guān)閉燈光及電源，離開實(shí)驗(yàn)室前記得洗手。 8、任何意外事件應(yīng)立即報告師長，并應(yīng)熟知相關(guān)的應(yīng)急措施。 藥品1、使用任何藥品，請先看清楚標(biāo)示、注意事項(xiàng)，翻閱物質(zhì)安全資料表

3、，查明是否對人體造成傷害，使用完畢請放回原位。 2、新配制的試劑請清楚注明內(nèi)溶物、濃度、注意事事項(xiàng)及配制日期，為避免污染，勿將未用完的藥劑倒回容器內(nèi)。 3、揮發(fā)性、腐蝕性、有毒溶劑（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、鹽酸、硫酸、b-mercaptoethanol、酚等）要在通風(fēng)櫥中戴手套量取配制，取用完后隨即蓋好蓋子，若不小心打翻試劑，馬上處理。 4、有毒、致癌藥劑例如acrylamide（神經(jīng)毒）、ethidium bromide（突變劑）、SDS、秋水仙素請戴手套及口罩取用，并勿到處污染，脫下手套后，應(yīng)養(yǎng)成洗手的好習(xí)慣。 5、接觸到病原材料或細(xì)菌，應(yīng)迅速消毒。所有被污染的物品，在丟棄或重復(fù)使用前均

4、需先滅菌，固體培養(yǎng)基不得倒入水槽或下水道中。 6、使用刻度吸管取物時，切勿用嘴吸取，請用自動吸管或安全吸球。 儀器1、使用儀器前先了解其性能、配置及正確操作方法，零件及附件嚴(yán)禁拆卸，勿私自調(diào)整，并注意插座電壓（110V或220V）之類別。 2、使用離心機(jī)時，離心管要兩兩對稱、重量平衡，鎖緊離心機(jī)轉(zhuǎn)陀。冷凍離心機(jī)于開機(jī)狀態(tài)時，務(wù)必蓋緊蓋子，以保持離心槽之低溫并避免結(jié)霜。 3、實(shí)驗(yàn)時不要用潮濕有汗的手去操作電器，不要用手緊握可能荷電的電器，不應(yīng)以兩手同時觸及電器，電器設(shè)備外殼均應(yīng)接地。萬一不慎發(fā)生觸電事故，應(yīng)立即切斷電源開關(guān)，對觸電者采取急救措施。 4、使用微波爐加熱時，不可有鋁箔等金屬物品，瓶蓋

5、必須松開，以免爆炸。加熱后戴防熱手套取出瓶子。5、使用UV燈時，不要以眼睛直視UV，應(yīng)隔著擋板觀察，完畢立即關(guān)燈。 6、超凈工作臺內(nèi)的酒精有機(jī)溶劑及易燃物（如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等）要遠(yuǎn)離火苗，不可留置火焰燃燒，萬一著火，應(yīng)力持鎮(zhèn)定，沉著處理。酒精或乙醚等著火時，應(yīng)使用泡沫滅火劑或濕毛巾覆蓋，勿使用水沖洗。 7、使用震蕩器震蕩培養(yǎng)時，注意三角瓶務(wù)必對稱放置，并用橡皮筋等夾緊，勿使其搖晃摔出臺面，否則需拆開并清除玻璃碎片與培養(yǎng)液。 急救措施1、急性呼吸系統(tǒng)中毒：應(yīng)使中毒者迅速離開現(xiàn)場，移到通風(fēng)良好的地方，呼吸新鮮空氣。如有休克、虛脫或心肺機(jī)能不全，必須先作抗休克處理，如人工呼吸、給予氧氣、喝興

6、奮劑（如濃茶，咖啡）等。2、經(jīng)由口服而中毒：需立即用3-5%小蘇打溶液或1：5000高錳酸鉀溶液洗胃，洗胃時要大量地喝，邊喝邊使之嘔吐，最簡單的催吐辦法是用手指或筷子壓舌根，或給中毒者喝少量（15-25毫升）1%硫酸銅或硫酸鋅溶液（催吐劑）。使之迅速將毒物吐出。洗胃要反復(fù)進(jìn)行多次，直至吐出物中基本無毒物為止。再服解毒劑，一般解毒劑有雞蛋清、牛奶、淀粉糊、桔子汁等。另外有些特殊解毒劑專對某種中毒而用。如磷中毒時用硫酸銅，鋇中毒時用硫酸鈉，氰化物中毒時用硫代硫酸鈉等。3、皮膚、眼、鼻、咽喉受毒物侵害時，應(yīng)立即用大量自來水沖洗，然后送醫(yī)院請各?？漆t(yī)生處理。4、一度燒傷：只損傷表皮，皮膚呈紅斑，微痛，

7、微腫，無水泡。如被化學(xué)藥品燒傷，應(yīng)立即用大量水沖洗，除去殘留在創(chuàng)面上的化學(xué)物質(zhì)，并用冷水浸沐傷處，可減輕疼痛，最后需要消毒，保護(hù)創(chuàng)面不受感染。 5、二度燒傷：損傷表皮及真皮層，皮膚起水泡，疼痛，水腫明顯。創(chuàng)面如污染嚴(yán)重，先用清水或生理鹽水沖洗，再以1：1000新潔爾滅消毒，不要挑破水泡，用消毒紗布輕輕包扎好，請醫(yī)生治療。 6、三度燒傷：損傷皮膚全層，包括皮下組織，肌肉，骨骼，創(chuàng)面呈灰白色或焦黃色，無水泡，不痛，感覺消失。在送醫(yī)院前，主要防止感染和休克，可用消毒紗布輕輕包扎好，給傷者保暖和供氧，必要時注射嗎啡止痛。7、炸傷：其急救措施基本同燒傷處理。但炸傷后傷口往往大量出血，應(yīng)立即將傷口上部扎緊

8、，防止流血過多。如發(fā)生昏迷、休克等，應(yīng)進(jìn)行人工呼吸，給氧，并送醫(yī)院治療。8、電擊傷：急救時首先使觸電者脫離電源，為此可拉下電閘或用木棍將觸電者從電源上撥開。當(dāng)心別把觸電者摔傷。斷開電源后，檢查傷員呼吸和心跳情況，若呼吸停止，立即進(jìn)行人工呼吸。對心跳亦停止者要同時進(jìn)行心臟擠壓。電擊傷比較輕微者，很快能恢復(fù)健康，重者必需請醫(yī)生治療。應(yīng)該注意，觸電者在進(jìn)行急救時，一般不要注射強(qiáng)心針和喝興奮劑。 9、一個人呼吸停止后24分鐘內(nèi)便會死亡，在這種情況下，如果對病人實(shí)行口對口的人工呼吸，將有起死回生的可能。 人工呼吸方法很多，有口對口吹氣法、俯臥壓背法、仰臥壓胸法，但以口對口吹氣式人工呼吸最為方便和有效。

9、A口對口或(真)吹氣法：此法操作簡便容易掌握，而且氣體的交換量大，接近或等于正常人呼吸的氣體量，對大人、小孩效果都很好。 操作方法： (1)病人取仰臥位，即胸腹朝天，頸后部(不是頭后部)墊一軟枕，使其頭盡量后仰。 (2)救護(hù)人站在其頭部的一側(cè)，自己深吸一口氣，對著傷病人的口(兩嘴要對緊不要漏氣)將氣吹入，造成吸氣。為使空氣不從鼻孔漏出，此時可用一手將其鼻孔捏住，在病人胸壁擴(kuò)張后，即停止吹氣，讓病人胸壁自行回縮，呼出空氣。這樣反復(fù)進(jìn)行，每分鐘進(jìn)行1416次。如果病人口腔有嚴(yán)重外傷或牙關(guān)緊閉時，可對其鼻孔吹氣(必須堵住口)即為口對鼻吹氣。 救護(hù)人吹氣力量的大小，依病人的具體情況而定。成人每次吹氣量

10、應(yīng)大于800毫升，但不要超過1200毫升。低于800毫升，通氣可能不足；高于2000毫升，常使咽部壓力超過食管內(nèi)壓，使胃脹氣而導(dǎo)致嘔吐，引起誤吸。一般以吹進(jìn)氣后，病人的胸廓稍微隆起為最合適?？趯谥g，如果有紗布，則放一塊疊二層厚的紗布，或一塊一層的薄手帕，但注意，不要因此影響空氣出入。 每次吹氣后搶救者都要迅速掉頭朝向病人胸部，以求吸入新鮮空氣。對小孩3秒一次，一分鐘20次。要規(guī)律地、正確地反復(fù)進(jìn)行。45次人工呼吸后，應(yīng)摸模頸動脈、腋動脈或腹股溝動脈。如果沒有脈搏，必須同時進(jìn)行心臟按摩。 B、俯臥壓背法：此法應(yīng)用較普遍，但在人工呼吸中是一種較古老的方法。由于病人取俯臥位，舌頭能略向外墜出，不

11、會堵塞呼吸道，救護(hù)人不必專門來處理舌頭，節(jié)省了時間(在極短時間內(nèi)將舌頭拉出并固定好并非易事)，能及早進(jìn)行人工呼吸，氣體交換量小于口對口吹氣法，但搶救成功率高于下面將要提到的幾種人工呼吸法。目前，在搶救觸電、溺水時，現(xiàn)場還多用此法。但對于孕婦、胸背部有骨折者不宜采用此法。 操作方法： (1)傷病人取俯臥仕，即胸腹貼地，腹部可微微墊高，頭偏向一側(cè)，兩臂伸過頭，一臂枕于頭下，另一臂向外伸開，以使胸廓擴(kuò)張。 (2)救護(hù)人面向其頭，兩腿屈膝跪于傷病人大腿兩旁，把兩手平放在其背部肩胛骨下角(大約相當(dāng)于第七對肋骨處)、脊柱骨左右，大拇指靠近脊柱骨，其余四指稍開。 (3)救護(hù)人俯身向前，慢慢用力向下壓縮，用力

12、的方向是向下、稍向前推壓。當(dāng)救護(hù)人的肩膀與病人肩膀?qū)⒊梢恢本€時，不再用力。在這個向下、向前推壓的過程中，即將肺內(nèi)的空氣壓出，形成呼氣，然后慢慢放松全身，使外界空氣進(jìn)入肺內(nèi)，形成吸氣。 (4)按上述動作，反復(fù)有節(jié)律地進(jìn)行，每分鐘1416次。實(shí)驗(yàn)操作須知1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計與要求 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計是由工作的目的和規(guī)模決定的，要合理布局，通常按自然工作程序先后安排成一條連續(xù)的生產(chǎn)線，避免有的環(huán)節(jié)倒排增加日后工作的負(fù)擔(dān)或引起混亂。房屋可規(guī)劃為洗滌室、滅菌室、配制室、無菌操作室、培養(yǎng)室、鑒定室、馴化移栽室等。1. 1準(zhǔn)備室 需備有的設(shè)備有：鼓風(fēng)干燥箱、落水架、工作臺、水池、水桶、水盆、試管刷等，主要用于玻璃器皿、用

13、具和培養(yǎng)材料清洗；還需要有高壓水龍頭用于沖洗。1.2滅菌室需備有高壓蒸汽滅菌裝置、細(xì)菌過濾器、用于培養(yǎng)基及培養(yǎng)器械的滅菌。1.3配制室 需備有冰箱、化學(xué)實(shí)驗(yàn)臺、藥品柜、器械柜、物品存放架以及各種玻璃器皿和用具，包括各種不同容積的容量瓶、燒杯、量筒、移液管、三角瓶、磨口瓶、廣口瓶、各種類型培養(yǎng)瓶、玻璃棒、移液管架、試管刷、電爐、微波爐等。1.4無菌操作室(接種室) 無菌操作室在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精細(xì)密閉，忌粗陋放散，是植物組織培養(yǎng)研究或生產(chǎn)工作中最關(guān)鍵的部分，關(guān)系到培養(yǎng)物的污染率，接種工作效率等重要指標(biāo)。要求如下:(1)地面、天花板及四壁盡可能光潔、避免積染灰塵，易于采取各種清潔措

14、施。 (2)干爽、安靜、清潔明亮，在適當(dāng)?shù)奈恢玫跹b紫外燈1-2盞，用以經(jīng)常照射滅菌，使室內(nèi)保持良好的無菌、低密度有菌狀態(tài)。 (3)最好安置一小型空調(diào)機(jī)，使室內(nèi)溫度保持在26左右，這樣就可以在工作時或不工作時都把工作室的門窗緊閉，保持與外界相對隔絕的狀態(tài)，盡量減少與外界的空氣對流，減少塵埃與微生物侵入。 (4)經(jīng)常采用消毒措施，達(dá)到較高的無菌水平，以利完全操作提高工作的質(zhì)量與效率。 (5)無菌室外應(yīng)留有緩沖間，進(jìn)入無菌室前在此更衣?lián)Q鞋洗手及處理外界采回準(zhǔn)備消毒培養(yǎng)的材料等。無菌操作室應(yīng)備有超凈工作臺或接種箱、固定式載物臺、移動式載物臺、廣口瓶、酒精燈、紗布、器械支架、手術(shù)剪、解剖刀、解剖針、鑷子

15、等。1.5培養(yǎng)室應(yīng)盡量安排在樓層較高處，以利于采光，減少塵埃和雜菌污染的機(jī)會。此外應(yīng)考慮清潔、干燥，培養(yǎng)室保溫隔熱。培養(yǎng)室中距離窗戶較遠(yuǎn)處的培養(yǎng)架應(yīng)適當(dāng)安裝人工輔助照明的日光燈。應(yīng)設(shè)計能有效通風(fēng)的窗戶、定期或需要時加強(qiáng)通風(fēng)散熱，如在室內(nèi)地板稍高處設(shè)置進(jìn)風(fēng)氣窗，在氣窗的對側(cè)近天花板設(shè)置排風(fēng)窗，也可安裝小功率的排風(fēng)扇。室內(nèi)應(yīng)備有制冷設(shè)備、加熱設(shè)備、控光設(shè)備、固定式培養(yǎng)架、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)架、搖床等。1.6鑒定室需備有高倍顯微鏡、倒置顯微鏡、相差顯微鏡、解剖鏡、恒溫箱、切片機(jī)、烤片臺、恒溫水浴、滴瓶、染色缸、載玻片、蓋玻片等。1.7馴化移植室 應(yīng)備有溫室、彌霧裝置、蔭棚、移植床、缽、盆、塑料布、草炭、蛭石

16、、粗沙等，用于試管小植株的鍛煉和移植。2、操作前的準(zhǔn)備工作接種室在接種前4-5 d必須通風(fēng)換氣。在接種前一天對接種室進(jìn)行全面消毒，一般用40%福爾馬林進(jìn)行全面噴霧，并密閉24 h，然后打開換氣窗10-15 min.。 接種前1 h打開超凈工作臺和棚面的紫外燈照射30 min。 殺菌結(jié)束后，先關(guān)掉棚面的紫外燈，再打開風(fēng)機(jī)，最后關(guān)掉超凈工作臺上的紫外燈。在接種后體息時，要先打開臺面的紫外燈，再關(guān)風(fēng)機(jī)，最后打開棚面紫外燈。不能將風(fēng)機(jī)與臺面上的紫外燈同時關(guān)閉或先關(guān)閉風(fēng)機(jī)再開紫外燈。不可穿工作服離開接種室，接種期間兩邊的門切記要關(guān)閉。3、準(zhǔn)備進(jìn)臺進(jìn)入接種室前，應(yīng)先將手表、手鐲、戒子、耳環(huán)等放在室外，將手

17、和手腕用肥皂洗凈后才能進(jìn)入接種室，并用75%酒精紗布擦拭雙手、雙腕(此紗布置于超凈工作臺外燒杯內(nèi)，并適時注入酒精)之后換上消毒的工作服、帽子、口罩(蓋上鼻子和嘴、著裝時注意頭發(fā)不得置于帽子外，袖口用皮筋扎緊)，進(jìn)入臺內(nèi)。 操作前用臺內(nèi)的酒精棉團(tuán)擦拭手、手腕，再擦培養(yǎng)基和超凈工作臺，一般按如下順序擦拭培養(yǎng)瓶：瓶的棉塞、瓶身、瓶底，徹底擦拭后放入超凈工作臺。4、接種操作 4.1、剪、鑷消毒 每次取出時剪口并攏，不可接觸磨口瓶和其它器皿，并保持尖端向下;剪、鑷分別在酒精燈外焰徹底灼燒，燒時將剪口鑷口張開，燒至剪、鑷上部，火焰熄滅后，插回磨口瓶。4.2、用上述消毒過的器械，將切割好的外植體插植到培養(yǎng)基

18、表面上，具體操作是： (1)左手拿三角瓶，解開包頭紙，將三角瓶幾乎水平拿著，靠近酒精燈焰，將瓶口外部在燈焰上燎數(shù)秒鐘，使瓶口的水氣散發(fā)掉。 (2)右手小指和無名指配合手掌將棉塞在燈焰附近慢慢拔出，以免空氣速向瓶內(nèi)沖擊，引起瓶口灰塵等沖入，造成污染。 (3)棉塞始終夾在右手兩手指之間，這時再將瓶口在燈焰上旋轉(zhuǎn)，使充分灼燒滅菌。 (4)用右手大、食、中指拿鑷子夾一塊外植體送入瓶內(nèi)輕輕的插入培養(yǎng)基中，鑷子灼燒后放回磨口瓶，再把棉塞在燈焰上灼燎數(shù)秒，灼燎時應(yīng)旋轉(zhuǎn)，避免燒壞，塞好棉塞，包上報紙，便完成了第一瓶的操作，接著再做第二瓶，如此直到外植體全部接完。 操作中必須遵守的事項(xiàng)：（1）棉塞不能亂放。手拿

19、的部分限于棉塞膨大的上半部分，塞入瓶口的那一段始終懸空，并不要碰到其它任何物體；若是螺旋蓋或薄膜，則應(yīng)解下放置在滅過菌的臺面上，放置處應(yīng)隨時用酒精棉團(tuán)涂抹滅菌。（2）操作人員的頭、胳膊等不得進(jìn)入臺內(nèi)。 （3）操作人員不得隨意談話、說笑，以免造成污染。 （4）臺外人員走動要輕、動作要小。 （5）接種完畢后注意標(biāo)明接種材料名稱、日期、處理。5、培養(yǎng)器材的清洗在細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)中，離體細(xì)胞對任何毒性物質(zhì)都十分敏感。毒性物質(zhì)包括解體的微生物和細(xì)胞殘余物以及非營養(yǎng)的化學(xué)物質(zhì)。某些化學(xué)物質(zhì)僅0.01g/L就會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此對培養(yǎng)器皿的清洗是組織培養(yǎng)中一項(xiàng)極為重要的環(huán)節(jié)。5.1、玻璃器皿浸泡 初次使用

20、和培養(yǎng)后的玻璃器皿都需用水浸泡。新用的玻璃器皿，常帶有許多干涸在上面的灰塵，同時又由于生產(chǎn)的原因，常呈堿性并帶有一些對細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，如鉛和砷等。在使用前要經(jīng)稀鹽酸（5%）浸泡，中和其中的堿性物質(zhì)便于清洗。用過的玻璃器皿往往帶有大量蛋白質(zhì)附著，干涸后不易刷洗掉，故用后要立即用清水浸泡。刷洗 浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗滌劑洗去玻璃器皿上的雜質(zhì)。刷洗次數(shù)太多，會損害器皿的表面光潔度，洗滌劑有使pH上升的趨勢，所以宜選用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)的洗滌劑。禁用去污粉，因其含有沙粒，會嚴(yán)重破壞玻璃器皿的光潔。酸洗 刷洗不掉的極微量雜質(zhì)經(jīng)過洗液的強(qiáng)氧化作用可被除掉。洗液對玻璃器皿無腐蝕作用，去污十分有效，

21、是清洗過程中最關(guān)鍵的一環(huán)。洗液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和水按一定比例配制而成，浸泡時，器皿要充滿洗液。常用的洗液配方見附表一。沖洗 刷洗和洗液浸泡后都必須用水充分沖洗，不留任何殘跡，然后用蒸餾水漂洗23次，涼干備用。5.2 塑料器皿塑料器皿耐腐蝕能力強(qiáng)，但質(zhì)地較軟，且不耐熱，因此它和玻璃器皿清洗不同。通常的方法是：先用清水充分浸泡和沖洗；再用2%NaOH溶液浸泡過夜，自來水沖洗，然后用5%稀鹽酸浸泡30分鐘，再用自來水沖洗，最后用蒸餾水漂洗3次，晾干備用。5.3 濾器玻璃濾器與玻璃器皿清洗相同。無論是浸泡還是酸浸，都可用抽濾法。1） 使用后，立即將清水注入濾器，抽氣過濾，反復(fù)抽濾5次。2） 干凈鉻

22、硫酸洗液或熱濃硫酸注入濾器，抽氣過濾至酸液濾過完畢。3） 用清水再次抽濾10次。4） 蒸餾水抽氣過濾3次。蔡氏濾器使用后棄去石棉濾膜，金屬部分刷洗干凈，最后用蒸餾水漂洗23次，晾干備用。新購置的膠塞帶有大量滑石粉，先用自來水沖洗干凈，常規(guī)處理，每次用后的膠塞用水浸泡，然后用2%NaOH煮沸15min左右，自來水沖洗，再用1%稀鹽酸浸泡30min，最后用自來水沖洗和蒸餾水漂洗，晾干后備用。實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基母液的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義1.學(xué)習(xí)和掌握培養(yǎng)基母液的配制方法。2.了解植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及基本設(shè)備，學(xué)習(xí)基本儀器設(shè)備的使用原理與方法MS培養(yǎng)基含有近30種營養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都

23、要對這幾十種成分進(jìn)行稱量，可將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量的擴(kuò)大一定的倍數(shù)，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養(yǎng)基母液。配制母液有2點(diǎn)好處：一是可減少每次配制稱量藥品的麻煩，二是減少極微量藥品在每次稱量時造成的誤差。當(dāng)配制培養(yǎng)基時，只需要按預(yù)先計算好的量吸取母液即可。母液可以配單一化合物母液，但一般都配成以下不同混合母液。應(yīng)注意以下幾個方面：A.藥品稱量應(yīng)準(zhǔn)確，尤其微量元素化合物應(yīng)精確到0.0001克，大量元素可精確到0.01克。B.配制母液的濃度適當(dāng)，一是長時間保存后易沉淀，二是濃度大，用量少，在配制培養(yǎng)基時易影響精確度。C.母液貯藏不宜過長，一般幾個月左右，要定期檢查，如出現(xiàn)渾濁、沉淀及霉菌等現(xiàn)象

24、，就不能使用。D.母液應(yīng)放在24的冰箱中保存。二、實(shí)驗(yàn)器材 分析天平（感量為0.0001g）、扭力天平（感量為0.01g）、臺秤（感量0.5g）、燒杯（500ml、100ml、50ml）、容量瓶（1000ml、100 ml、50 ml、25 ml）、細(xì)口瓶（1000 ml、100 ml、50 ml、25 ml）、藥勺、玻璃棒、電爐。三、實(shí)驗(yàn)藥品NH4NO3、KNO3、CaCl22H2O、MgSO47H2O、KH2PO4、KI、 H3BO3、 MnSO44H2O、 ZnSO47H2O、 Na2MoO42H2O、CuSO45H2O、CoCl26H2O、FeSO47H2O、Na2-EDTA2H2O、

25、肌醇 、煙酸、鹽酸吡哆醇(維生素B6)、鹽酸硫胺素(維生素B1)、甘氨酸、多效唑、乙烯利、NAA、6-BA、KT、2，4-D、IAA、ABA、IBA、矮壯素、玉米素、100%乙醇、氨水。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、大量元素母液的配制大量元素混合母液:指濃度大于0.5mmolL的元素,即含N、P、K、Ca、Mg、S等六種鹽類的 混合溶液各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大10倍，用感量為0.01g的扭力天平稱取，用蒸餾水分別溶解，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000ml的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時，每配1L培養(yǎng)基取此液100ml。 表1 MS培養(yǎng)基大量

26、元素母液制備序號藥品名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴(kuò)大10稱量(mg)1NH4NO3165016500蒸餾水定容至1000ml2KNO31900190003CaCl22H2O44044004MgSO47H2O37037005KH2PO41701700注意：(1) 配制大量元素母液時，某些無機(jī)成分如Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等離子錯開

27、混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。 (2)CaCl22H2O要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl22H2O時，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸騰，操作時要防止其溢出。 （3）.溶解時最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生； （4）.夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因?yàn)樗袔Ь窟^大而產(chǎn)生沉淀，、微量元素母液的配制微量元素混合母液:指小于0.5mmolL的元素，即含除Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等鹽類的混合溶液。微量元素用量較少，特別是CuSO45H2O、CoCl26H2O，因此在配制中分微量、配制。按照表2，表3配方，用感量為

28、0.0001g的電光分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基，取微量10ml，微量ml表2 MS培養(yǎng)基微量的配制序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴(kuò)大100倍稱量(mg)1MnSO44H2O22.322302ZnSO47H2O8.68603H3BO36.26204KI0.83835Na2MoO42H2O02525表3 MS培養(yǎng)基微量的配制序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴(kuò)大1000倍稱量(mg)1CuSO45H2O0.025252CoCl26H2O0.02525注意：使用電子分析天平時注意不要把藥品撒到稱盤上，用完以后，用吸耳球?qū)⑻炱絻?nèi)的臟物清理干凈。3、鐵鹽母液的配

29、制鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時，配制1L取此液10ml。表4 MS鐵鹽母液的配制序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴(kuò)大100倍稱量(mg)1Na2-EDTA 37.337302FeSO47H2O27.82780注意：在配制鐵鹽時，如果加熱攪拌時間過短，會造成Fe S 04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時若將其冷藏，F(xiàn)e S 04會結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時，F(xiàn)e

30、S 04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后，保持加熱，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2EDTA溶液中并不斷攪拌，接近沸騰時停止加熱，待溶液冷卻后把pH值調(diào)到5.5，置于棕色細(xì)口瓶中，室溫放置冷卻后，再冷藏。4、有機(jī)母液的配制MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時用電子分析天平。配制葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。生物素在熱水與稀堿中溶解注意：由于維生素母液營養(yǎng)豐富，因此貯藏時極易染菌。被菌類污染的維生素母液，有效濃度降低，并且易給后期培養(yǎng)造成傷害，不宜再用。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:配制母液時用無菌重蒸

31、餾水溶解維生素，并貯存在棕色無菌瓶中，或縮短貯藏時間。表5 MS培養(yǎng)基有機(jī)物質(zhì)母液的制備序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴(kuò)大倍數(shù)稱量(mg)配制體積(L)1甘氨酸210002000.12鹽酸硫胺素(VB1)0.41000400.13鹽酸吡哆素(VB6)0.51000500.14煙酸0.51000500.1表6 肌醇母液的制備序號化合物名稱培養(yǎng)基濃度（mg/L）擴(kuò)大倍數(shù)稱量(mg)配制體積(L)1肌醇10020020000.15、 植物生長物質(zhì)母液配制植物組織培養(yǎng)中使用的植物生長物質(zhì)種類及含量需要根據(jù)不同的研究目的而定。一般母液的配制的終濃度以0.5mg/ml為好，需要注意的是：（）配制生長

32、素類，例如IAA、NAA、2.4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。（）細(xì)胞分裂素，例如KT，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加34滴1mol/L的鹽酸溶解，再用蒸餾水定容。注意：所有的母液都應(yīng)保存在04冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。6、生長延緩劑的配制 矮壯素、多效唑乙醇溶解，再用蒸餾水定容。7、常用溶液的配制 （1）0.1%升汞（HgCl2，有劇毒）溶液：稱取1g HgCl2少許水溶解，1000ml水定容。 （2）用95%嘗試酒精配比不同濃度的酒精的配制（十字交叉法）。95（酒精） 75 750（

33、蒸餾水） 2095%酒精：蒸餾水=75：20 （3）1摩爾濃度(mg/L )NaOH l配制。稱取NaOH4g，用少量溶解，定容100ml. （4）1摩爾濃度（mg/L）HCl的摩爾濃度要求配制的mol濃度需配制的體積原酸分子量V原酸的百分濃度原酸的比重1000 配制1.0MHCl100ml，量取38%，比重為1.19的HCl8.06ml加蒸餾水，定容至100ml。五、思考題：1、 配制母液時為什么要按順序加入各藥品？溶解CaCl22H2O時，為什么要將蒸餾水加熱？2、 請寫出你所配制的各種母液配方附1：植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置 1、化學(xué)實(shí)驗(yàn)室：主要進(jìn)行器具的洗滌、干燥和保存、藥品的稱量、溶解

34、.配制、培養(yǎng)基的分 裝、包扎和滅菌、植物材料的預(yù)處理、培養(yǎng)材料的觀察分析等。2、接種室：主要進(jìn)行植物材料的接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代等。3、無菌培養(yǎng)室：是人工條件下培養(yǎng)接種物及試管苗的場所。4、洗滌室：若需成批生產(chǎn)時,需要一間單獨(dú)的洗滌室。5、觀察室：放置顯微鏡.解剖鏡或照相設(shè)備，便于對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行認(rèn)真觀察、分析和照相。6、儲存室：暫時不用的器皿、用具的存放、也可用作種質(zhì)保存。7、溫室：用于試管苗的煉苗.移栽;植物材料的預(yù)培養(yǎng)等.附2:實(shí)驗(yàn)藥品規(guī)格說明 GR：優(yōu)級純。主成份含量很高、純度很高，適用于精確分析和研究工作，有的可作為基準(zhǔn)物質(zhì)。 AR：分析純。主成份含量很高、純度較高，干擾雜質(zhì)

35、很低，適用于工業(yè)分析及化學(xué)實(shí)驗(yàn)。 CP：化學(xué)純。主成份含量高、純度較高，存在干擾雜質(zhì)，適用于化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。 LR：實(shí)驗(yàn)純。主成份含量高、純度較差，雜質(zhì)含量不做選擇，只適用于一般化學(xué)實(shí)驗(yàn)和合成制備。 BR：生化試劑。用于配制生物化學(xué)檢驗(yàn)試液，和生化合成。質(zhì)量指標(biāo)注重生物活性雜質(zhì)?？商娲甘緞┖陀袡C(jī)合成。BS：生物染色劑。適用于配制生物標(biāo)本染色液。質(zhì)量指標(biāo)注重生物活性雜質(zhì)。可替代指示劑和有機(jī)合成。 Indictor：指示劑。 HPLC：適用于高壓液相色譜的試劑。 進(jìn)口試劑規(guī)格說明 Ultra Pure：超純，與GR級相近。 High Purity：高純，與AR級相近。 Biotech：生物技

36、術(shù)級，簡稱生技，與BR級相近。 Reagent：試劑級，與CP級相近。 ACS：美國化學(xué)學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)，與AR級相近。 USP：藥用級。 除常用規(guī)格外還有一些特殊用途試劑 特 純 EP 分 析 用 PA 合 成 FS 基 準(zhǔn) PT 分 光 純 UV 紅外吸收 IR 液相色譜 LC 核磁共振 NMR 光 譜 純 SP Spectrum pure 氣相色譜 GC Gas chromatography實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義學(xué)習(xí)培養(yǎng)基配制與滅菌的操作方法。對植物外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)時，要依靠培養(yǎng)基提供生長所需的營養(yǎng)成分。不同材料對培養(yǎng)基的要求不同，適當(dāng)?shù)脑O(shè)計和選用培養(yǎng)基，對植物組織培養(yǎng)取

37、得成功至關(guān)重要的。另外，對組織培養(yǎng)物的脫分化和再分化等狀態(tài)的調(diào)控，次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等都是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來實(shí)現(xiàn)的。培養(yǎng)基的主要成分包括無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)、碳源、有機(jī)物質(zhì)、植物生長物質(zhì)等。二、實(shí)驗(yàn)器材天平、燒杯（1000ml）、醫(yī)用瓷缸（1000 ml）、三角瓶、量筒（100ml）、移液管、玻璃棒、pH試紙、吸耳球、線繩、封口膜、石棉網(wǎng)。三、實(shí)驗(yàn)藥品蔗糖、葡萄糖、活性炭、Vc、PVP、瓊脂糖、瓊脂、1mol/L NaOH、HCl、各種培養(yǎng)基母液。四、實(shí)驗(yàn)步驟配制愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2，4-D 1.5mg/L+CH 500mg/L+ 3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH 5.8。（一） 培養(yǎng)基配制（以1L

38、 MS培養(yǎng)基為例）1、計量 根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式：吸取量 ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）1000ml/母液濃度（mg/L）。2、移液取醫(yī)用瓷缸一只，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。注意：在使用提前配制的母液時，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進(jìn)行配制。用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳希咳?種，劃掉1種，以免出錯；移液管不能混用，并保證移液管尖部沒有破損

39、。3、稱取稱取7g瓊脂，30g蔗糖備用4、融化用搪瓷量杯量取600700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。注意：在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。5、混合將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾次。6、調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(5.

40、47.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止(在調(diào)制時要比目標(biāo)pH值偏高0.20.5個單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會下降0.20.5個單位左右)。注意：調(diào)至?xí)r要用玻璃棒不停的攪拌,使其充分混合。7、分裝培養(yǎng)基合成后要趁熱分裝，100ml的容器約裝入30-40ml培養(yǎng)基，高度約為錐形瓶容量的1/51/4，即1L培養(yǎng)基約裝30瓶左右。太多則浪費(fèi)培養(yǎng)基，太少不易接種和影響生長。但要根據(jù)培養(yǎng)對象來決定。如果培養(yǎng)時間較長時，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基，生根等短期培養(yǎng)時，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后污染8、包扎 用封口膜封口，外邊也可加一層牛皮紙，扎

41、好繩子，注明培養(yǎng)基的名稱及配制日期。寫上培養(yǎng)基種類，準(zhǔn)備滅菌。注意不能放置時間過長，以免產(chǎn)生污染。培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。注意：培養(yǎng)基中的部分成分在高溫滅菌時易發(fā)生化學(xué)變化，致使培養(yǎng)基pH值降低，從而使瓊脂凝固力下降，發(fā)生培養(yǎng)基滅菌前凝固，滅菌后不凝固現(xiàn)象。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:調(diào)整培養(yǎng)基pH值，一般不低于5.6，若需酸性較強(qiáng)培養(yǎng)基，可適當(dāng)增加瓊脂用量。（二）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基中含有大量的有機(jī)物質(zhì)，特別含糖量較高，是各種微生物滋生、繁殖的好場所。而接種材料需要在無菌條件下培養(yǎng)很長時間，如果培養(yǎng)基被污染，則達(dá)不到培養(yǎng)的預(yù)期結(jié)果。因此，培養(yǎng)基的滅菌，是植物組織培養(yǎng)中十分重要的環(huán)節(jié)。

42、常用的滅菌方法是高壓滅菌和過濾除菌。1、高壓蒸汽滅菌法把分裝好的培養(yǎng)基及所需滅菌的各種器具、蒸餾水等，放入高壓蒸汽滅菌鍋的消毒桶中，外層鍋內(nèi)加水，水位高度不超過支架高度。蓋好鍋蓋，上好螺絲，注意上螺絲要對角線上。加熱后，鍋上壓力表指針開始移動，當(dāng)指針移至0.5kg/cm2時，扭開放氣閥排除冷空氣，使壓力表指針回復(fù)零位。當(dāng)指針移至1.11.2kg/cm2時，即121時，維持一定的時間。由于容器的體積不同，瓶壁的厚度不同，所以滅菌的時間也要適當(dāng)考慮，具體可以參考表1。滅菌后要趁熱取出三角瓶，不可久不放汽，讓壓力鍋?zhàn)孕欣鋮s，這樣易將棉塞等悶得太濕，引起后來長霉污染。培養(yǎng)基自然冷卻凝固。放置1 d后再

43、使用。表1 培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必須的最少時間容器的體積(ml)在121下最少滅菌時間(min)205015751502025050025100030150035200040注意：（1）鍋內(nèi)冷空氣必須排盡，否則壓力表指針雖達(dá)到一定壓力，但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在事實(shí)上達(dá)不到應(yīng)有的溫度，因而影響滅菌效果。當(dāng)達(dá)到一定壓力后，注意在保持壓力過程中，嚴(yán)格遵守滅菌時間，時間過長會使一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)基成分，時間短則達(dá)不到滅菌效果。對蒸餾水，各種器具滅菌時，滅菌時間要適當(dāng)延長，壓力也要提高，一般在126維持一個小時。另外三角瓶中的液體不超過總體積的70%，否則當(dāng)溫度超過100時，培養(yǎng)基會噴溢，造成

44、培養(yǎng)瓶壁和封口膜的污染。（2）消毒后的培養(yǎng)基不能立即用于接種，而應(yīng)放置24-72h。放置后如果培養(yǎng)基中沒有出現(xiàn)菌落，則說明培養(yǎng)基是無菌的，才可以用于接種。另外做好的培養(yǎng)基一般應(yīng)在1-2周內(nèi)用完，短時間可存放于室溫條件，如不能盡快用完，應(yīng)放在4條件下。表2 飽和蒸汽壓力與其對應(yīng)的溫度飽和蒸汽壓力kg/cm2 磅/平方英寸 溫度飽和蒸汽壓力kg/cm2 磅/平方英寸 溫度0.001001.05515121.00.1412103.61.12516122.00.2814106.91.26618124.10.4426109.81.40620126.00.5638112.61.54322127.80.70

45、310115.21.68124129.60.84412117.630134.50.98414119.950147.62、過濾除菌培養(yǎng)基中某些成分是熱不穩(wěn)定的，在高溫濕熱滅菌中可能會降解。這類物質(zhì)需要進(jìn)行過濾滅菌。例如一些生長因子，如赤霉素(GA)、玉米素、脫落酸、尿素和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。先將除去了不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基其它成分經(jīng)高壓滅菌后置于超凈工作臺上冷卻至40,再將過濾滅菌后的該化合物按計劃用量依次加入,搖勻,凝固后即可使用。如果是液體培養(yǎng)基，沒有凝固這個問題，則可在冷卻到室溫后再加入。 除菌濾膜其孔徑尺寸一般要小于或等于0.4m。過濾滅菌的原理，

46、是溶液通過濾膜時，細(xì)菌的細(xì)胞和孢子等因大于濾膜孔徑而被阻。濾膜的吸附作用力也不容忽視，往往小于濾膜孔徑的細(xì)菌等亦不能透過。在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置。液量少時可用注射過濾器，它由注射器、濾器(可更換)、持著部分和針管等幾部分組成。注射器不必先經(jīng)高壓滅菌，而后面幾部分要預(yù)先用鋁箔或牛皮紙等包扎好，最好放在有螺旋蓋的玻璃罐中，經(jīng)高壓滅菌，濾器滅菌不應(yīng)超過121。由于這個“注射過濾滅菌器”小巧、方便、實(shí)用，在液量多時多用幾套這種裝置(亦可適當(dāng)重復(fù)使用)也能順利完成液體滅菌操作。在使用前按無菌操作要求將注射過濾滅菌器的幾個部分裝配在一起，把吸有需要過濾滅菌溶液的注射器插入細(xì)菌過濾器與之

47、相配合的插接口，推壓注射器活塞桿，將溶液壓過濾膜，從針管部分滴出的溶液就是無菌溶液了，但是濾膜不能阻擋病毒粒子通過。在一般情況下，人工配制的溶液不會含有使植物致病的病毒。更嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)研究中，這一點(diǎn)仍不容忽視。毫無疑問，過濾過的溶液要按無菌操作要求盡快加入培養(yǎng)基中，以免重新遭到污染。假如需經(jīng)過濾滅菌的溶液帶有沉淀物，那么在過濾滅菌之前可用3號燒結(jié)玻璃濾器預(yù)先予以去除，這樣可以減少細(xì)菌濾膜微孔被堵塞的情況。五、實(shí)驗(yàn)報告1、根據(jù)所給母液濃度、蔗糖、瓊脂用量、pH值，按給出的培養(yǎng)基配方計算各種母液吸取量，填入下表：培養(yǎng)基配方：MS+KT1.0+BA2.0+NAA0.2+蔗糖3%+瓊脂0.7%，pH5.

48、8。表1 按上述配方計算各種母液吸取量并填入下表藥品名稱母液濃度1L培養(yǎng)基母液吸取量0.3L培養(yǎng)基母液吸取量大量元素10倍液微量元素100倍液微量元素1000倍液鐵鹽100倍液VB10.4mg/mlVB60.5mg/ml煙酸0.5mg/mlGly1mg/ml肌醇20mg/mlBA0.5mg/mlKT0.5mg/mlNAA0.5mg/ml蔗糖瓊脂pH值5.8實(shí)驗(yàn)三 愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義1、學(xué)習(xí)誘導(dǎo)植物外植體形成愈傷組織的方法。2、掌握無菌操作技術(shù)植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的重要因素，對有些植物材料而言，生長素和細(xì)胞分裂素對保持愈傷組織的快速生長是必要的，特別是兩者結(jié)合使用

49、時，能更強(qiáng)烈的刺激愈傷組織的形成。二、實(shí)驗(yàn)器材超凈工作臺、鑷子、解剖刀、酒精燈、棉球、燒杯、廣口瓶、培養(yǎng)皿三、實(shí)驗(yàn)藥品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸鈉、無菌水、直根胡蘿卜、培養(yǎng)基母液、2，4-D、水解酪蛋白（CH）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基配置誘導(dǎo)胡蘿卜愈傷組織的培養(yǎng)基為：MS+2，4-D 1.5mg/L+CH 500mg/L+ 3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH 5.8。愈傷組織增殖培養(yǎng)基：MS+2，4-D 0.5mg/L+CH 500mg/L + 3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH 5.8。2、胡蘿卜營養(yǎng)根的消毒。a.將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織。將胡蘿卜切段，每段厚約0.5cm

50、。b.把胡蘿卜段用無菌水漂洗干凈。c.用75%的酒精溶液浸泡30s。d.用0.1%氯化汞浸泡2、5.10.12min，在浸泡過程中用鑷子攪拌，以使消毒充分。e.浸泡過的胡蘿卜段用無菌水沖洗3-5次，洗去殘留的氯化汞后切片。3、解除三角瓶上捆扎的線繩，有必要的話可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培養(yǎng)基處理整齊排列在接種臺左側(cè)，然后用75%酒精擦洗接種臺表面。 4、胡蘿卜營養(yǎng)根切片胡蘿卜營養(yǎng)根由外向內(nèi)依次分為皮層、形成層和中軸三部分。在切片消毒之前首先除去皮層的最外層，以減少胡蘿卜營養(yǎng)根的帶菌量。形成層的分生能力最強(qiáng)，是產(chǎn)生愈傷組織的主要部分，因此在切片時應(yīng)使每一個切片上都

51、有形成層。具體操作方法和步驟如下：胡蘿卜的截面圖 沿圖中豎線切開 沿圖中豎線切成首先沿橫線把胡蘿卜段切開 兩邊部分棄去（如圖） 切片，每片厚0.5-1mm 圖1 胡蘿卜營養(yǎng)根切片的制作注意：消毒以后的所有操作過程，都應(yīng)在超凈工作臺上進(jìn)行，操作所用的鑷子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中，使用時在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后再切割。5、輕輕打開封口膜，將三角瓶口在火焰上方灼熱滅菌，同時把長鑷子也放在火焰上方灼燒，將燒過的鑷子觸動培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后將培養(yǎng)皿打開一小縫，用鑷子取出切好的胡蘿卜切片放到培養(yǎng)基表面，用鑷子輕輕向下按一下，使切片部分進(jìn)入培養(yǎng)基。在酒精燈

52、火焰上轉(zhuǎn)動三角瓶一圈使瓶口灼熱滅菌。然后用封口膜封口，封口膜要及時捆綁，其松緊度以用手轉(zhuǎn)不動為準(zhǔn)；下臺前要把品種代號、培養(yǎng)基類型、個人編號以及接種日期標(biāo)示到瓶上。離開之前還要把工作臺收拾干凈，把接種過程中產(chǎn)生的垃圾清理掉，臺上的物品也要擺放整齊。注意：植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)愈傷組織形成的極為重要的因素，研究具體問題要設(shè)置一定的濃度梯度，以尋找最佳濃度。五思考題1、接種5天后觀察污染情況，計算污染率。污染率=污染的材料數(shù)/總接種材料數(shù)100%2、每周觀察并記錄胡蘿卜外植體產(chǎn)生愈傷組織的情況，包括培養(yǎng)物形態(tài)的變化，愈傷組織出現(xiàn)的時間以及愈傷組織的形態(tài)特征（愈傷組織的顏色、質(zhì)地等），愈傷組織的生長狀況

53、等，計算愈傷組織誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的材料數(shù)/總接種材料數(shù)100%接種日期觀察日期接種數(shù)污染數(shù)誘導(dǎo)數(shù)誘導(dǎo)率愈傷組織的特征及生長狀況附1：初代培養(yǎng)建立時應(yīng)注意的問題（1）從室外取得材料，要用自來水沖洗數(shù)分鐘，對表面不光滑或長有絨毛等結(jié)構(gòu)不容易洗凈的材料，沖洗時間要長，必要時要用毛刷刷洗。（2）外植體消毒劑的選擇要綜合考慮消毒效果、不同材料對滅菌劑的耐受力、滅菌劑的去除等因素,最好選用兩種消毒劑交替浸泡,初次實(shí)驗(yàn)滅菌時間要設(shè)置一定的時間梯度來確定最佳的滅菌時間。常用的消毒劑的見表1。如果培養(yǎng)材料大部分發(fā)生污染，說明消毒劑浸泡的時間短；若接種材料雖然沒有污染，但材料已發(fā)黃，組織變軟，表明消毒

54、時間過長，組織被破壞死亡；接種材料若沒有出現(xiàn)污染，生長正常，即可以認(rèn)為消毒時間適宜。（3）工作臺接種時，應(yīng)盡量避免做明顯擾亂氣流的動作（比如說、笑、打噴嚏），以免影響氣流，造成污染。另外操作過程中要不時用75%的酒精擦拭雙手。（4）接種前培養(yǎng)基出現(xiàn)大量污染現(xiàn)象,若菌類只存在于培養(yǎng)基表面，且主要是真菌時，可能是因培養(yǎng)瓶密封不嚴(yán)或放置培養(yǎng)基的環(huán)境不潔凈，菌類種群密度過大所致。若菌類存在于培養(yǎng)基內(nèi)部，則可能是由使用污染的貯藏母液引起。另外培養(yǎng)瓶不潔凈，滅菌不徹底也是導(dǎo)致接種前培養(yǎng)基污染的原因。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:保持環(huán)境潔凈，杜絕使用污染的母液，嚴(yán)格高壓蒸汽滅菌程序，保證滅菌時間。（5）接種后培養(yǎng)基出現(xiàn)大面積污染、菌落分布不勻,此種情況主要是接種過程中發(fā)生的污染所致。可能是接種室不潔凈、菌類孢子過多、鑷子帶菌、操作人員手未徹底消毒、操作人員呼吸及超凈工作臺。出現(xiàn)故障等原因引起。避免此現(xiàn)象發(fā)生的方法是:保持無菌接種室潔凈，并定期用甲醛等熏蒸滅