抗體制備過程

1、單克隆抗體制備過程,臨床獸醫(yī)系:吳黎明 學(xué)號：08302110124,單抗技術(shù)的基本原理 小鼠骨髓瘤細胞能在動物體外無限繁殖和分泌無抗體活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾細胞具有產(chǎn)生抗體的能力，但不能無限增殖，又能產(chǎn)生特異性抗體，可通過有限稀釋法經(jīng)篩選培育成由單個細胞增殖而成的克隆株。該克隆株如不發(fā)生變異，就可大批量的生產(chǎn)高特異性和高純度的單抗。,單克隆抗體的優(yōu)越性 1. 目的性明確 人們可以在動物體內(nèi)或體外按自己的需要生產(chǎn)不同類型的單抗。任何抗原、半抗原，包括各種細菌、病毒、激素、酶類、氨基酸序列、核酸，還有其它異體蛋白或糖蛋白等均可以用來免疫動物，利用雜交瘤技術(shù)獲得相應(yīng)的單抗。,2. 特異性高

2、 單抗是針對某一種特定抗原或抗原上特定決定簇制備的，與其它抗原無交叉反應(yīng)性。與其它常規(guī)免疫血清相比，單抗的特異性高、效價高、質(zhì)地均一，便于精制濃縮，應(yīng)用單抗可以提高檢測方法的敏感性和特異性。同時，他又可作為提純抗原、制備疫苗、生產(chǎn)生物制劑和用于基礎(chǔ)研究的重要手段。 3 .生產(chǎn)簡單，易于標準化 一旦選育成功一株高效價的雜交瘤細胞株，經(jīng)鑒定合格后可置液氮中長期保存。如不發(fā)生變異，染色體不丟失，就可長久源源不斷的大批生產(chǎn)高特異性和高純度的單抗,單克隆抗體制備示意圖,一、細胞融合前準備,(一)免疫方案 選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立

3、免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。 要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。,初次免疫 Ag150g加福氏完全佐劑皮下多點注射 (一般0.81ml0.2ml點) 3周后 第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip) (ip劑量不宜超過0.5ml) 3周后 第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip (57天后采血測其效價，檢測免疫效果) 23周后 加強免疫，劑量50500g為宜，ip或iv(靜脈內(nèi)注射) 3天后 取脾融合,(二)

4、飼養(yǎng)細胞 在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。,小鼠腹腔巨噬細胞的制備 小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠610周齡 拉頸處死浸泡于75酒精，消毒35分鐘 用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜 用無菌注射器注入68ml培養(yǎng)液 反復(fù)沖洗，吸出沖洗液 放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)分離心56分鐘 用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)110ml 加入96孔板，100l孔 放入37CO2孵箱培養(yǎng),一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得58106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作

5、為飼養(yǎng)細胞時，細胞濃度為5106ml，小鼠脾細胞為1106ml，小鼠的成纖維細胞(3T3)1105ml，均為100l孔。,(三)骨髓瘤細胞 骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。 常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。,骨髓瘤細胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在1020，細胞的最大密度不得超10ml，一般擴大培養(yǎng)以110稀釋傳代，每35天傳代一次。細胞的倍增時間為1620小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可

6、懸起細胞。,一般在準備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每36月應(yīng)用8AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變。 保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95，也是決定細胞融合的關(guān)鍵。在細胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為2105/ml，次日一般即為對數(shù)生長期細胞。,(四)免疫脾細胞 免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。 脾細胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器

7、針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的倍，細胞數(shù)為10左右。,二、細胞融合，選擇雜交瘤,(一)細胞融合流程 (1)取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞SP20，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。 (2)同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。 (3)將骨髓瘤細胞與脾細胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。 (4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。 (5)輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。 (6)在室溫下融合可先以預(yù)熱40:

8、 30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45PEG(Merek,分子量4000)含5DMSO，邊加邊攪拌。 作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。 加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。,(7)離心，800rpm，6分鐘。 (8)棄上清，先用6ml左右20小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。 (9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。 (10) 將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培養(yǎng) (一般一塊96孔板含有1107脾細

9、胞) 。 （11） 第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液，勿將固定于孔底的細胞吸出，根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細胞。 （12）于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察，大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數(shù)雜交瘤細胞在1020天內(nèi)出現(xiàn)，但也有在1個月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細胞出現(xiàn)后，吸取上清液，檢查抗體。（13） 對繼續(xù)生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中，依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS1640液。同時保存于液氮和進行克隆化，在這期間每代都要檢查抗體，以防止產(chǎn)生抗體細胞的變異和丟

10、失。,(二)HAT選擇雜交瘤 一般在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50貯存，用時1ml加入50ml20小牛血清完全培養(yǎng)液中。 因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細胞、融合后的細胞，200l孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加3倍量的HAT。我們認為，融合后最初補加的量可用全量的23進行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。 50HAT H:510-3M A:210-5M T:810-4M 一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。,三、抗體的檢測,篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細

11、胞布滿孔底110面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。,四、雜交瘤的克隆化和凍存,克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。,1.有限稀釋法的程序 制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前準備) 陽性孔細胞的計數(shù)，并調(diào)細胞數(shù)在1510ml 取130

12、個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞ml，100l孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個ml，100l孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)5個ml，100l孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。 培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養(yǎng)液200l孔。 第89天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。 注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。,2.軟瓊脂法 軟瓊脂的配制 含20FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPM

13、I1640 1瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。 0.5瓊脂：由1份1瓊脂加1份含20小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42保溫。 用上述0.5瓊脂液(含有飼養(yǎng)細胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。 按100ml，500ml或5000ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。 1ml 0.5瓊脂液(42預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37，5CO2孵箱中。 45天后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔板中進行培養(yǎng)。 檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要時再

14、克隆化。,(二)雜交瘤細胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。 雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。 細胞凍存液: 50小牛血清 40不完全培養(yǎng)液 10DMSO(二甲亞砜),五、單克隆抗體的大量生產(chǎn),大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種： 1.

15、體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。 2.體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。 實體瘤法對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按13107ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共24點。待腫瘤達到一定大小后(一般1020天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mgml。但采血量有限。 腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1106個雜交瘤細胞，接種細胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而

16、小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。,六、單克隆抗體的鑒定,對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定: 1.抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細胞因子間有無交叉。,2.McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELIS