ELISA原理方法及操作細(xì)節(jié)

1、ELISA,酶聯(lián)免疫吸附試驗,主講人：劉,暢,研究生,導(dǎo),師：馬學(xué)恩,教,授,ELISA,酶聯(lián)免疫吸附試驗,Enzymes linked immunosorbent assay,簡,介,1971,年，瑞典學(xué)者,Engvail,和,Perlmann,荷蘭學(xué)者,Van Schuurs,分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中,微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附,試驗,ELISA,就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反,應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù),該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原,抗,體系統(tǒng)均可用以檢測,酶和抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體與抗原,免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué),

2、活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使,基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型,變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物可用肉眼,光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可用分光光,度計加以測定。呈色反應(yīng)顯示了酶的存在，從,而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng),所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì),胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位,或在微克，甚至納米水平上對其進(jìn)行定量,基,本,原,理,先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上,并保持其免疫活性,測定時，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步,驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng),用洗滌的方法分離抗原,抗體復(fù)合物和游離成分,然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定

3、性或定,量,方,法,類,型,酶聯(lián)免疫吸附試驗的主要技術(shù)類,型有雙抗體夾心法、間接法、競,爭法、捕獲法等,1,雙抗體夾心法,此法常用于檢測抗原,它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇,A,和,B,分別與固相載體上的抗體,A,和酶標(biāo)記抗體,B,結(jié),合，形成,抗體,A,待測抗原,酶標(biāo)抗體,B,復(fù)合物,復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬非,競爭性反應(yīng)類型,抗,體,A,待測抗原,酶標(biāo)抗體,包被物,2,間接法測定抗體,此法常用于測定抗體,將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與,抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成,抗原,待,測抗體,酶標(biāo)二抗的復(fù)合物,復(fù)合物的形成量,與待測抗體量成正比，屬非競爭性反應(yīng)類型,抗,

4、原,待測抗體,酶標(biāo)二抗,包被物,3,競,爭,法,此法既可用于檢測抗原和半抗原,也可以用于檢測抗體,用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測的非標(biāo)記抗原,抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體,抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，則形,成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就,少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程,度與待測物含量成反比,限量的的抗體,酶標(biāo)抗原,樣品抗原,酶標(biāo)多于樣品,顯色程度深,樣品多于酶標(biāo),顯色程度淺,顯色程度與待測物含量成反比,包被物,4,捕獲法（反向間接法,主要用于測定血清中某種抗體亞成分,以目前最常用的,IgM,測定為例，因血清中針對某,種抗原的特異性,IgM,和,IgG,同時存在，而后者可,

5、干擾,IgM,的測定。因此，先針對,IgM,的第二抗體,如羊抗人,IgM,鏈抗體）連接于固相載體，用以,捕獲”樣品中所有,IgM,洗滌除去,IgG,等無關(guān),物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待測,IgM,結(jié)合；再,次加入抗原特異的酶標(biāo)抗體；最后形成固相二,抗,IgM,抗原,酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯色后,即可對待,IgM,進(jìn)行定性和定量測定,針對,IgM,的第二抗體,待測物,其中含有,IgM,和,IgG,特異性抗原與,IgM,結(jié)合,酶標(biāo)抗體,包被物,IgG,等無關(guān)物質(zhì),被洗脫,具,體,步,驟,包被,封閉,加待測物,加一抗，二抗,或抗原等,顯色,包,被,用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶,聯(lián)板（聚乙

6、烯微量反應(yīng)板），每孔,100,用保鮮膜包好,4,過夜,如急用，包被,2h,后，清洗也可用，但最好,過夜,次日棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干,用,PBST,洗液，洗,45,次,每次在洗板機清洗酶聯(lián)板上震蕩,23min,后,在面巾紙上拍干后進(jìn)行下一次清洗或下一步,包,被,液,0.05M PH 9.6,磷酸鹽緩沖液,Na,2,CO,3,1.59 g,NaHCO,3,2.93g,加蒸餾水至,1000ml,PBST,洗,液,2000ml PBS + 1ml,Tween-20,PBS,NaCl 8g,KCl 0.2g,Na,2,HPO,4,1.42g,KH,2,PO,4,0.27g,加,1000ml,蒸餾

7、水定容，調(diào),PH,至,7.4,洗,板,機,封,閉,用封閉液封閉，每孔,100,室溫下，在微量振蕩器上，封閉,2h,棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干,用,PBST,洗液，洗,45,次。（同包被,用保鮮膜包好,4,可保存一個月,封,閉,液,10 ,小牛血清,1ml,小牛血清加到,9ml 1,PBS,中混勻,5,脫脂奶粉（用洗液稀釋,加標(biāo)準(zhǔn)樣及樣品,待測樣或標(biāo)準(zhǔn)一抗,用,PBST,洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔,100l,包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器,上孵育,2,小時。清洗,二抗,用,PBST,洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔,100l,包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器,上孵育,1,小時。清洗,注,意,

8、抗體抗原反應(yīng)比較快，一般,12,個小時就,達(dá)到峰值。延長反應(yīng)時間容易出現(xiàn)非特異,結(jié)合，但反應(yīng)時間不能少于,1.5,小時,二抗的使用濃度（一般,1,10000,稀釋,應(yīng)當(dāng)進(jìn)行預(yù)實驗確定，二抗的反應(yīng)時間不,能過長，容易出現(xiàn)非特異反應(yīng)。一般，反,應(yīng),4060,分即可,OPD,顯,色,臨用前取,A,液,5.14ml,B,液,4.86ml,加入,OPD,鄰苯二胺，在,20中保存,0.0040g,約,4,小片），溶解后加入50l的,30%H,2,O,2,配成顯色液。,OPD,要充分混,勻，否則容易出現(xiàn)個別孔顏色太深,顯色液每孔100l。避光顯色,1520min,用,2mol,L H,2,SO,4,終止反應(yīng)

9、，每孔50l,顯,色,液,A,液,0.2mol,L Na,2,HPO,4,Na,2,HPO,4,12H,2,O 71.7g,加水至,1000ml,B,液,0.1 mol,L,檸檬酸,檸檬酸,19.2g,檸檬酸，加水至,1000ml,結(jié),果,判,定,酶標(biāo)測定儀檢測,429nm,測定,OD,值,待測孔,P,與對照孔,N,的比值,P,N,大于,1.5,或,2,者為陽性,注意：要有陰性，陽性對照,應(yīng),用,ELISA,法由于測定靈敏、特異、操作簡便,酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定、易于自動化、無反,射性污染，且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，使,其成為目前應(yīng)用最廣泛而且發(fā)展最快的一,種免疫測定技術(shù)。市場上符合質(zhì)量要求的,商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體,酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成,分