食品學(xué)院-腸溶多肽水凝膠對保加利亞乳桿菌的控釋作用研究

1、中南林業(yè)科技大學(xué)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實驗計劃項 目 結(jié) 題 報 告項目名稱腸溶多肽水凝膠對保加利亞乳桿菌的控釋作用研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)項目主持人劉馥歌所在學(xué)校及院系中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院項目級別國家級 省級 校級立項年份2014年9月指導(dǎo)老師張琳聯(lián)系電表日期2016年11月中南林業(yè)科技大學(xué)教務(wù)處制填寫說明一、本表要按要求逐項認真填寫，填寫內(nèi)容必須實事求是，表達明確嚴謹?？杖表椧睢盁o”。二、格式要求：表格中的字體用小四號仿宋體，1.5倍行距；需簽字部分由相關(guān)人員以黑色鋼筆或水筆簽名。均用A4紙雙面打印，于左側(cè)裝訂成冊。三、本頁不裝訂。一、基本情況項目名稱

2、腸溶多肽水凝膠對保加利亞乳桿菌的控釋作用研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)立項時間2014年9月完成時間2017年4月項目主要研究人員序號姓 名學(xué)號專業(yè)班級所在院（系）項目中的分 工1劉馥歌20133936糧食工程1班食品科學(xué)與工程學(xué)院負責(zé)人2郭勝雄20133932糧食工程1班食品科學(xué)與工程學(xué)院水凝膠制備操作探究3李艷20133934糧食工程1班食品科學(xué)與工程學(xué)院水凝膠性質(zhì)檢測及數(shù)據(jù)記錄4周曉華20133959糧食工程1班食品科學(xué)與工程學(xué)院菌的活化培養(yǎng)檢測及資料整理分析5二、研究成果簡介項目成果類型產(chǎn)品 系統(tǒng)軟件 論文 專利 其它（注：請在相應(yīng)成果復(fù)選框內(nèi)打“”，其它請具體說明）項目成果名稱珍珠奶項目研究的目

3、的、意義；研究成果的主要內(nèi)容、重要觀點或?qū)Σ呓ㄗh；研究成果和研究方法的特色；實踐意義和社會影響。限定在2000字以內(nèi)。（一）主要目的：本實驗旨在研究具有包埋和保護特性的腸溶性多肽雜化水凝膠，利用腸溶性多肽雜化水凝膠為載體對腸道益生菌保加利亞乳桿菌進行包埋。在胃液中，包有腸道益生菌的凝膠能夠保護益生菌不受強酸破壞，并能穩(wěn)定存在，以減少直接食用腸道益生菌而導(dǎo)致的失活問題；在腸道中，包有腸道益生菌的凝膠從弱堿性環(huán)境中釋放出益生菌，以達到益生的作用。（二）項目意義：目前，市場上銷售的益生菌飲料大都直接將益生菌添加在飲料中，通過直接飲用，飲料中的益生菌（特別是腸道益生菌）在胃液中已經(jīng)失活，無法被人體有效

4、利用。針對該問題，本項擬利用腸溶性多肽雜化水凝膠包裹保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌，在酸性條件下（胃液環(huán)境中）凝膠包裹保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌，以保護其活性；在弱堿性條件下（腸道環(huán)境中）凝膠的三級網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)坍塌，使保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌釋放出來，從而實現(xiàn)其在腸道中的功能，達到被人體更好利用的效果。本課題的研究將為益生菌提供一種可以在腸道中控制釋放的新型包埋材料，為解決益生菌在胃酸條件下失活的問題提供有效的方法。（三）研究成果的主要內(nèi)容1研制出酸性條件下分解的多肽水凝膠一種，利用其包埋大蒜精油，研究了包埋率及其對大蒜精油的控制釋放作用。2 完成了具有腸溶特性的多肽雜化水凝

5、膠的配方及其特性研究。3 利用腸溶性多肽雜化水凝膠包埋保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌，并檢測了包埋率。4 模擬胃腸道環(huán)境，將凝膠包埋后的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌以及未經(jīng)包埋的樣品分別放到模擬胃腸道環(huán)境下，研究了包埋和未包埋的混合菌在胃中存活率和腸道中的釋放性，從而研究了腸溶性多肽雜化水凝膠對混合菌的控制釋放作用。5將包埋了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌的凝膠加入到乳酸飲料中制成初步產(chǎn)品。（四）重要觀點及建議：1本項目利用多肽作為水凝膠因子，通過改變多肽的序列和配方，成功研制出中性條件下包埋，酸性條件下釋放的多肽水凝膠 (Fmoc-F)，并用其包埋大蒜精油，可以控制大蒜精油在大

6、腸桿菌的對數(shù)生長期時釋放并起到抑菌效果。通過包埋，多肽水凝膠成功掩蓋了大蒜精油的不良氣味。2 本項目也成功研究出了酸性條件下成膠，腸道條件下溶解的多肽雜化水凝膠，利用其包埋保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌，成功起到了在胃酸條件下保護混合菌，在腸道中釋放的作用?？傊ㄟ^本項目的研究，我們成功研制出了pH響應(yīng)的多肽水凝膠，不同的水凝膠對大蒜精油和保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌具有良好的控制釋放作用。因此，對于易揮發(fā)的有效成分或者容易被胃酸破壞的有效成分，我們可以通過生物相容性好的多肽水凝膠進行包埋，起到保護作用，為食品工業(yè)中包埋材料的發(fā)展提供有效的途徑。（五）研究成果和研究方法的特色研究成果：

7、1. 通過本項目的研究，我們于2016年7月在中文核心期刊糧食與油脂雜志上發(fā)表論文“自組裝多肽水凝膠包埋大蒜精油的控釋研究”一篇；2. 制出腸溶性多肽雜化水凝膠，并將其添加入乳制品中，制成產(chǎn)品。相關(guān)論文還在撰寫中。研究方法的特色：本項目較早將多肽水凝膠應(yīng)用到食品活性成分的控制釋放領(lǐng)域，對食品活性成分的包埋材料的研究具有重要意義。（六）實踐意義和社會影響：通過本項目的研究，我們研制出了具有pH響應(yīng)的多肽水凝膠：一種在酸性條件下分解的水凝膠，可應(yīng)用于大蒜精油的包埋，通過包埋可以控制大蒜精油在大腸桿菌的對數(shù)生長期釋放起到抑菌效果；一種腸溶性多肽雜化水凝膠，可以包埋腸道益生菌，在胃酸條件下保護益生菌不

8、失活，在腸道環(huán)境中凝膠分解并釋放出益生菌，使其發(fā)揮生物活性。本項目的研究為食品活性成分的包埋材料提供了一個新的方向，具有較強的實用價值，后期進入市場會具有一定的社會影響。三、項目研究總結(jié)報告項目研究和實踐情況，研究工作中取得的主要成績和收獲，研究工作有哪些不足，有哪些問題尚需深入研究，研究工作中的困難、問題和建議。（字數(shù)不限，可加頁面）（一）項目研究和實踐情況1研制出酸性條件下分解的多肽水凝膠一種，利用其包埋大蒜精油，研究了包埋率及其對大蒜精油的控制釋放作用。2 完成了具有腸溶特性的多肽雜化水凝膠的配方及其特性研究。3 利用腸溶性多肽雜化水凝膠包埋保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌，并檢測了包

9、埋率。4 模擬胃腸道環(huán)境，將凝膠包埋后的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌以及未經(jīng)包埋的樣品分別放到模擬胃腸道環(huán)境下，研究了包埋和未包埋的混合菌在胃中存活率和腸道中的釋放性，從而研究了腸溶性多肽雜化水凝膠對混合菌的控制釋放作用。5將包埋了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌的凝膠加入到乳酸飲料中制成產(chǎn)品。（二）實驗結(jié)果如下：1 Fmoc-F自組裝多肽水凝膠包埋大蒜精油實驗1.1 Fmoc F自組裝多肽水凝膠的形成如圖1所示，將Fmoc F 溶解在NaOH溶液后，溶液中的Fmoc F分子呈現(xiàn)無規(guī)則狀態(tài)（圖1A）。加入GDL后，GDL水解生成的H +使溶液pH逐漸下降至Fmoc F的等電點附近。此時

10、，分子間的非共價鍵力（疏水作用力、氫鍵、 堆積等）使Fmoc F分子逐步聚集，組裝成規(guī)則有序的一維納米結(jié)構(gòu)（圖1B），隨著組裝的進一步深入，一維納米結(jié)構(gòu)相互纏結(jié)成三維的多孔狀網(wǎng)絡(luò)，從而束縛住水分子形成了透明的、自支撐的半固體凝膠（圖1C）8。在該水凝膠體系中，F(xiàn)moc F的濃度僅為1 % ( w / v)，即一分子Fmoc F可以束縛2152個水分子，說明Fmoc F具有非常強的截留能力。圖1 Fmoc F凝膠制備示意圖1.2 Fmoc F自組裝多肽水凝膠及 環(huán)糊精對大蒜精油的包埋率圖2 大蒜精油含量標準曲線 以大蒜精油濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標做大蒜精油含量標準曲線，如圖2。由圖2可知，

11、濃度在1.80 mg / L 10.80 mg / L時，大蒜精油在210 nm下的吸光值與大蒜精油濃度呈良好的線性關(guān)系，標準曲線方程為Y = 0.0146 + 0.0761 X（R 2 = 0.996）。 分別利用Fmoc F自組裝多肽水凝膠和 環(huán)糊精對大蒜精油進行包埋，利用大蒜精油含量標準曲線計算包埋率，比較包埋物的芯材壁材比，結(jié)果如表2表1 Fmoc F自組裝多肽水凝膠及 環(huán)糊精包埋產(chǎn)物性質(zhì)包埋材料包埋率芯 / 壁材比（mL：g）Fmoc F自組裝多肽水凝膠97.07 %1 : 0.42 環(huán)糊精6.60 %1 : 8從表1可知，F(xiàn)moc F自組裝多肽水凝膠對大蒜精油的包埋率（97.07

12、%）顯著大于 環(huán)糊精（60.60%），而且包埋1 mL芯材，所需要的Fmoc F質(zhì)量（0.42 g）僅為 環(huán)精（8 g）的5.25%。因此，F(xiàn)moc F自組裝多肽水凝膠是一種高效的大蒜精油包埋材料。1.3 Fmoc F自組裝多肽水凝膠的pH響應(yīng)特性為了研究Fmoc F自組裝多肽水凝膠在不同pH條件下的分解情況，分別將Fmoc F凝膠置于不同pH的緩沖溶液中檢測其分解率，如圖3。圖3 不同pH條件下Fmoc F自組裝多肽水凝膠的分解率Fmoc F成膠后，測得其pH為7.2。在pH = 6.5的緩沖液中，凝膠僅在最初的5 min內(nèi)分解了11.1 %（圖3，pH 6.5），在隨后的5 150 min

13、內(nèi)幾乎沒有分解（150 min，分解率12.17 %）。在pH = 6.0和pH = 5.5的緩沖液中，凝膠的分解率逐漸增長，到90 min時其分解率分別為35.44 %和51.48 %（圖3，pH 6.0和pH 5.5），90 150 min內(nèi)分解率（150 min，34.70 %和51.56 %）沒有顯著變化。在pH = 5.0的緩沖液中，前90 min FmocF的分解率不斷增加，90 min時有91.45 %的Fmoc F凝膠分解（圖3，pH 5.0），在150 min時凝膠徹底分解（分解率100 %）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)moc F凝膠對pH有顯著響應(yīng)。在pH = 7.2時，分子之間的非

14、共價鍵力作用使得凝膠形成；在pH 6.5時，凝膠幾乎不分解，其三級網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且完整；當pH 19（表1，當n = 30， = 0.001時，所需最少正確答案數(shù)為19)，所以 0.001，A、B兩個樣品存在極顯著差別。給出正確答案的評價人員均表示，B樣品有強烈的刺激性大蒜氣味，而A樣品幾乎不存在不良氣味，這說明Fmoc F凝膠幾乎可以完全掩蓋大蒜精油的不良氣味。2 混合菌的活化與培養(yǎng)和腸溶性水凝膠的探索結(jié)果由于保加利亞不易培養(yǎng)，因此我們保加利亞乳桿菌換成保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌有利于保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)。2.1 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌總數(shù)表5保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合

15、菌總數(shù)平板bccef稀釋倍數(shù)10100100010000100000菌落數(shù)/（cfu，ml）不可計數(shù)不可計數(shù)不可計數(shù)20420菌落總數(shù)/（cfu，ml）2.0*108我們稱取0.5g直投式混合菌粉溶于5ml生理鹽水中 制作原始菌液，以e組平板為樣品，進行平板計數(shù)，經(jīng)計算得到菌總數(shù)2.0*108cfu/ ml。2.2腸溶性多肽成膠過程中pH值的變化測定分別在加GDL之前，剛加入GDL，以及加入GDL至完全成膠三個時間段進行pH測定，如表6所示：表6腸溶性水凝膠pH的測定環(huán)境條件A（加GDL前）B（剛加GDL）C（成膠后）水凝膠pH值測定9.556.164.15從表中可看出加入GDL后，GDL水解

16、生成的H +使溶液pH逐漸下降。此時，分子間的非共價鍵力（疏水作用力、氫鍵、-堆積等）使FmocY分子逐步聚集，組裝成規(guī)則有序的一維納米結(jié)構(gòu)，隨著組裝的進一步深入，一維納米結(jié)構(gòu)相互纏結(jié)成三維的多孔狀網(wǎng)絡(luò)，從而束縛住水分子形成了透明的、自支撐的半固體凝膠。3腸溶性多肽水凝膠的包埋與檢測3.1腸溶性水凝膠在模擬胃、腸道中釋放情況的研究圖4雜化膠m（Fmoc-F）：m（明膠）為1/14時在不同pH下隨時間的分解情況圖 圖4為雜化膠包埋直接放置在不同PH下隨時間變化，吸光度的變化值，從圖4中，可以看出PH為7.5和9.0的雜化膠分解能力強，在PH為1.7條件下雜化膠的分解性能差。因此我們得出：該雜化膠

17、具有很好的pH響應(yīng)，可用作包埋混合菌的載體。3.2雜化膠包埋活菌的存活率包埋率隨明膠濃度變化圖 通過用不同配比的雜化膠對對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌進行包埋，并測定其保留率，得到雜化膠的最佳配比。圖5(a) 在m（Fmoc-F）：m（明膠）比例為1/14的雜化膠 包埋率隨明膠濃度的變化圖5(b) 在明膠濃度為25%條件下雜化膠內(nèi)不同比例對混合菌的包埋率由圖5（a）可知，在雜化膠比例一定時混合菌的包埋率隨著明膠濃度的升高而增大，與Fmoc-Y的含量無顯著關(guān)系。由圖5 ( b )可知，在兩種膠比例為1/14時隨著pH增大，溶解度增大，當明膠濃度大于55%后，無法成膠。因此，出于釋放時間的考慮

18、，我們選擇了明膠濃度為55%，m(Fmoc-Y)/m(明膠)=1/14這一配比。3.3 保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的包埋與檢測本實驗采用直投式菌粉作為原料，直接取菌粉在復(fù)活后包入水凝膠中，待成型后先放入胃液模擬液中并在震蕩器中放置2小時，隨后向其中加入腸道模擬液并放置1小時繼續(xù)取部分均與混合液并測定菌活性。表7：水凝膠對保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的包埋率載體水凝膠包埋率/%97.452.31 參考文獻利用大豆皮果膠凝膠包埋保加利亞乳桿菌的初步研究 中，果膠在不同PH下對保加利亞乳桿菌的包埋率70.132.65，由表6可知腸溶性水凝膠對混合菌的包埋效果比果膠的包埋效果好。表8：在模擬胃腸道環(huán)境下

19、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌的存活率樣品水凝膠不包埋存活率/%85.502.034.432.13由表8得出在模擬的胃腸道環(huán)境中水凝膠包埋的混合菌存活率為85.502.03遠高于不包埋的混合菌，表明保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌經(jīng)腸溶性雜化水凝膠包埋后其耐酸性顯著提高。3.4成功將包埋有混合菌的水凝膠投放到飲料中。 圖6（a） 圖6（b）圖6表示的是包埋保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌的腸溶性雜化水凝膠在稀釋過的乳酸飲料中的靜置狀態(tài)（原飲料呈乳白色無法看到水凝膠的存在），從圖中可知腸溶性水凝膠在飲料中性質(zhì)較為穩(wěn)定。（三）研究工作中取得的主要成績和收獲通過本項目的研究，我們研制出了具有pH相應(yīng)的多肽水凝膠:一種酸性條件下分解的水凝膠可應(yīng)用于大蒜精油的包埋，通過包埋可以控制大蒜精油在大腸桿菌的對數(shù)生長期釋放起到抑菌效果；一種腸溶性多肽水凝膠可以包埋乳酸菌，在胃酸條件下保護乳酸菌不失活，在腸道環(huán)境中分解釋放乳酸菌，使其發(fā)揮生物活性。在本次實驗探究中，我們對水凝膠的性能，作用，理化性質(zhì)有了更深的理解，在研究實驗的方法上我們掌握了更好的方法讓實驗更加有效，此外，在這個過程中我們四個人分工明確，有問題及時解決，配合度大大提高，在遇到失敗時，一