藥品生物檢定技術ppt課件

1、第八章 藥品生物檢定技術簡介,藥品生物檢定技術是指利用生物體（微生物、細胞、離體組織或動物）對藥物的特定藥理、毒理作用，來測定生物藥品的效價、檢查藥品中的有害物質以及對制劑進行微生物限度或無菌檢查的技術方法,抗生素效價的微生物檢定法,生化藥物效價的生物測定法,藥品的安全性檢查,第一節(jié) 無菌檢查,概述,無菌檢查法 系用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。 將藥品或材料，在嚴格的無菌操作條件下，接種于適合各種微生物生長的不同培養(yǎng)基中，置于不同的適宜溫度下培養(yǎng)一定的時間，逐日觀察微生物的生長情況，并結合陽性和陰性對照試驗的結果，判斷供試品是否無菌。 包括薄膜過

2、濾法和直接接種法兩種方法,一、常規(guī)技術要求,1.應在環(huán)境潔凈度10000級以下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內或隔離系統(tǒng)中進行檢查。 2.全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。 3.單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證,二、培養(yǎng)基,一）培養(yǎng)基的種類：7種 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基） 改良馬丁培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)基） 選擇性培養(yǎng)基 0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（用于硫酸鏈霉素等抗生素的無菌檢查） 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基,二、培養(yǎng)基,二）培養(yǎng)基的適用性檢查 證明：培養(yǎng)基

3、無菌，且能保證細菌生長良好 1.無菌性檢查,每批培養(yǎng)基隨機取不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應無菌生長,二、培養(yǎng)基,二）培養(yǎng)基的適用性檢查 2.靈敏度檢查,方法：取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結果。 結果判斷：空白對照管無菌生長，加菌培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定,二、培養(yǎng)基,二）培養(yǎng)基的適用性檢查 適用

4、性檢查的菌種： 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉,圖片取自青島海博生物技術有限公司,三、方法驗證試驗,建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證 證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查 排除供試品是否具有抑細菌和抑真菌作用 避免假陰性結果 方法：薄膜過濾法、直接接種法,四、無菌檢查法,一）檢驗數(shù)量及檢驗量 中國藥典現(xiàn)行版附錄 批出廠產(chǎn)品最小檢驗數(shù)量表 液體制劑最小檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量表 固體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數(shù)量表,四、無菌檢查法,二）對照試驗 1.陽性對照 必須長菌，用以證明微生物確實可在應用的試驗條件下生長 根據(jù)供試品

5、特性選擇陽性對照菌 無抑菌作用和抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌 抗革蘭陰性菌為主的供試品，以大腸埃希菌為對照菌 抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌 抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌 陽性對照管培養(yǎng)4872小時應生長良好,四、無菌檢查法,二）對照試驗 2.陰性對照 不得長菌，用以檢查試驗過程中使用的溶劑、稀釋液、沖洗液等對微生物生長及存活無影響,四、無菌檢查法,三）檢查方法 1.薄膜過濾法 通過濾膜過濾，將供試品中可能存在的微生物富集于濾膜上，再沖洗掉濾膜上的抑菌成分后，在薄膜過濾器濾筒內加入培養(yǎng)基，在所需溫度下培養(yǎng)，觀察是否有菌生長,四、無菌檢查法,三）檢查方法 2.

6、直接接種法 3.培養(yǎng)及觀察 將含培養(yǎng)基的容器在規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，逐日觀察并記錄是否有菌生長。必要時可轉種及涂片,五、無菌檢查結果判斷,三）檢查方法 1.陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。 2.若供試品管顯澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定。 3.若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。 4.試驗若經(jīng)確認無效，需依法重試,第二節(jié) 微生物限度檢查,微生物限度檢查法 系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受到微生物污染程度的方法，檢查項目包括細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。

7、 微生物限度檢查成為非規(guī)定滅菌制劑保證藥品質量的重要檢查內容，也是綜合評價藥品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)衛(wèi)生狀況的一個依據(jù),一、常規(guī)技術要求及檢驗量,一）技術要求 1.檢查應在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。 2.單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證。 3.供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。 4.細菌培養(yǎng)溫度為3035；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328；控制菌培養(yǎng)溫度為3537。 5.檢驗結果以1g、

8、1ml、10g、10ml或10cm2為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告,一、常規(guī)技術要求及檢驗量,二）檢驗量 一次試驗所用的供試品量(g、ml或cm2)。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加 20g或20ml。 檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4片。一般應隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量供試品,二、樣品供試液的制備,中國藥典現(xiàn)行版附錄中提供了液體供試品、固體、半固體或黏稠性供試品以及需用特殊方法制備供試液的供試品的供試液制備方

9、法。 需用特殊方法制備供試液的供試品有：非水溶性供試品、膜劑供試品、腸溶及結腸溶制劑供試品、氣霧劑、噴霧劑供試品及具抑菌活性的供試品,三、菌種及培養(yǎng)基,一）菌種 1.細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)檢查的對照試驗菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、 白色念珠菌、黑曲霉 2.控制菌檢查的對照菌種 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌,三、菌種及培養(yǎng)基,二）培養(yǎng)基 1.細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)檢查常用的培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。 2.控制菌檢查常用的培

10、養(yǎng)基 用于菌液制備的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等常規(guī)培養(yǎng)基 膽鹽乳糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基等20余種用于培養(yǎng)基適用性檢查、方法驗證試驗及供試品檢查的培養(yǎng)基,三、菌種及培養(yǎng)基,白色念珠菌 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,大腸埃希菌 曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基,四、方法的驗證試驗,建立微生物限度檢查法時，應先進行方法驗證： 確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、霉菌、酵母菌的菌落計數(shù)測定或控制菌的檢查。 選擇法定試驗菌按照規(guī)定的方法及要求進行,五、藥品的微生物限度檢驗方法,一）細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 檢測的是藥物在單位質量或體積內所存在的活菌數(shù)量 評價生產(chǎn)過程中原輔料、設備、器具、工藝、環(huán)境及操作者的衛(wèi)生狀況,五、藥品的微

11、生物限度檢驗方法,一）細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 1.計數(shù)方法的驗證 用以保證方法中供試液沒有抗菌活性、培養(yǎng)條件適宜細菌、霉菌及酵母菌生長、制備過程中稀釋劑未受微生物干擾、供試液稀釋級選擇適宜。 驗證試驗包括試驗組、菌液組、供試品對照組及稀釋劑對照組 判斷指標:各試驗菌每次試驗的菌數(shù)回收率,五、藥品的微生物限度檢驗方法,一）細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 2.供試品檢查方法 （1）平皿法 根據(jù)菌數(shù)報告規(guī)則取相應稀釋級的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520ml溫度不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細菌）或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（霉菌）或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌），混勻，凝固，倒置培

12、養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。平皿法以培養(yǎng)后細菌、霉菌或酵母菌在瓊脂平板上形成的獨立可見的菌落為計數(shù)依據(jù)，按照菌數(shù)報告規(guī)則進行報告。 同時取試驗用的稀釋液1ml，同法操作，作為陰性對照試驗。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長,細菌、霉菌計數(shù),圖片截取自原中國藥品生物制品檢定所無菌檢查和微生物檢查操作規(guī)范視頻,五、藥品的微生物限度檢驗方法,一）細菌、霉菌及酵母菌計數(shù) 2.供試品檢查方法 （2）薄膜過濾法 所用濾膜孔徑不大于0.45m，直徑一般為50mm。 取相當于每張濾膜含1g 、1ml或10 cm2供試品的供試液（或適宜稀釋級的供試液1ml），加至適量的稀釋劑中，混勻，

13、過濾。用pH 7.0無菌沖洗液沖洗濾膜后，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。根據(jù)菌數(shù)報告規(guī)定計數(shù)，如超過規(guī)定限量即可認定不合格。 同時取試驗用的稀釋液1ml同法操作，作為陰性對照，陰性對照不得有菌生長,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 檢查非規(guī)定滅菌制劑中是否存在有可疑的致病菌 控制菌檢查項目包括大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌及白色念珠菌,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 1.適用性檢查 適用性檢查項目包括促生長能力、

14、抑制能力及指示能力的檢查 促生長能力檢查用以保證在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間內，試驗菌生長良好（液體培養(yǎng)基）、菌落大小、形態(tài)特征與對照菌一致（固體培養(yǎng)基） 抑制能力檢查用以保證其他試驗菌無法生長 指示能力檢查用以保證培養(yǎng)基上試驗菌的生長情況（液體培養(yǎng)基）、菌落大小、形態(tài)特征（固體培養(yǎng)基）、指示劑反應情況等與對照培養(yǎng)基一致,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 2.方法驗證試驗 控制菌檢查方法的驗證試驗 用以保證方法中供試液沒有抗菌活性、所采用方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 3.陽性對照試驗和陰性對照試驗 試驗菌的陽性對照試驗：

15、應檢出相應的控制菌 稀釋液的陰性對照試驗：應無菌生長,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 4.控制菌檢查法 （1）大腸埃希菌 檢查法：取供試液在膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml 4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養(yǎng)基的試管內，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，為靛基質陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質陰性,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 4.控制菌檢查法

16、（2）大腸菌群 在乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管中，分別加入110、1100、11000的供試液1ml，用稀釋劑1ml作為陰性對照，均培養(yǎng)1824小時，觀察結果,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 4.控制菌檢查法 （3）沙門菌 檢查法：取供試液在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時后，劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂）培養(yǎng)基平板上，根據(jù)培養(yǎng)后平板上有無菌落生長、或生長的菌落形態(tài)特征，判斷是否檢出沙門菌。如菌落形態(tài)特征相符或疑似，還應通過用三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面進行斜面和高層穿刺接種試驗做進一

17、步判斷,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 4.控制菌檢查法 （4）銅綠假單胞菌 檢查法：取供試液在膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)液，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，根據(jù)培養(yǎng)后平板上有無菌落生長、或生長的菌落形態(tài)特征，判斷是否檢出銅綠假單胞菌。如菌落形態(tài)特征相符或疑似，還應通過氧化酶試驗及綠膿菌素試驗做進一步判斷,五、藥品的微生物限度檢驗方法,二）控制菌檢查 4.控制菌檢查法 （5）金黃色葡萄球菌 檢查法：取供試液在亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基的培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上。根據(jù)培養(yǎng)后平板上有無菌落生長、或生長的菌落形態(tài)特征，判斷

18、是否檢出金黃色葡萄球菌。如菌落形態(tài)特征相符或疑似，還應通過血漿凝固酶試驗做進一步判斷,第三節(jié) 抗生素效價的微生物檢定法,抗生素微生物檢定法 在適宜條件下，根據(jù)量反應平行線原理設計，通過檢測抗生素對微生物的抑制作用，計算抗生素活性（效價）的方法。 中國藥典現(xiàn)行版：管碟法和濁度法,一、檢定原理,標準品溶液和供試品溶液 量反應平行線原理：在相同試驗條件下，標準品溶液和供試品溶液對試驗菌所得的量反應曲線，在一定劑量范圍內互相平行 檢定方法 管碟法：二劑量法、三劑量法 濁度法：二劑量法、三劑量法、標準曲線法,二、試驗菌,管碟法試驗菌： 枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸埃希菌、

19、啤酒酵母菌、肺炎克雷伯菌、支氣管炎伯德特菌。 濁度法試驗菌： 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌,三、管碟法,利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。 國際上抗生素藥品檢定的經(jīng)典方法。 中國藥典法定方法：二劑量法和三劑量法,三、管碟法,四、濁度法,利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養(yǎng)后細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法。 中國藥典現(xiàn)行版法定方法：標準曲線法、二劑量法和三劑量法,第四節(jié) 生化藥物效價的生物測定法,生化藥品 采用生物化學方法，從生物材料中分離、純化、精制而成的用以治療、預防和診斷疾病的藥品如氨基酸、肽、蛋白質、酶類 劑量以效價（單位）表示 中國藥典現(xiàn)行版正