DNA、RNA及蛋白質操作技術ppt課件

1、第 五 章 分子生物學研究法 （上）DNA、RNA及蛋白質操作技術,基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心技術。 基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達,根癌土壤農桿菌（Agrobaoterium tumefaciens）侵染植物細胞后能將其Ti（tumor inducing）質粒上的一段DNA（T-DNA）插入到被侵染細胞的基因組，并能穩(wěn)定地遺傳給后代，植物的遺傳轉化（植物基因工程）技術隨之得到迅

2、速發(fā)展,5. 1 重組DNA技術史話 基因工程技術是核酸操作技術的一部分，只不過它強調了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。 事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術區(qū)別于其它生命科學技術的根本特征,表5-1重組DNA技術史上的主要事件,上個世紀中下葉以來，現代分子生物學的迅猛發(fā)展源自工具酶的發(fā)現。 （一）限制性核酸內切酶 能夠識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。 第一個核酸內切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現的，它能特異性識別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產生具有粘性末端

3、的小片段,圖5-1 幾種主要DNA內切酶所識別的序列及其酶切末端,圖5-2 DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個整體,多聚核苷酸鏈中新生磷酸糖苷鍵的產生過程,單核苷酸5-磷酸基團向核酸鏈的3-OH發(fā)起進攻,RE 切割隨機DNA分子（假定4種堿基在DNA中均勻分布）的概率由該酶所識別的堿基數目按照4n 來計算，如一個6堿基切割酶平均每4096 bp核DNA有一個酶切位點（46），而一個4堿基切割酶平均每256 bp核DNA就有一個酶切位點（44,重組DNA實驗中常見的主要工具酶,嘌呤,腺嘌呤,鳥嘌呤,嘧啶,胞嘧啶,尿嘧啶,胸腺嘧啶,組成DNA和RNA分子的五種含氮堿基的結構式,僅僅能在體外

4、利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上，才能在寄主細胞中進行繁殖,具備自主復制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質粒等小分子量復制子都可以作為基因導入的載體,二）基因克隆的載體 1、pSC101質粒載體 長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內切酶的單酶切位點，在HindIII、BamHI和SalI等3個位點插入外源基因，會導致tetr失活,大腸桿菌pSC101質粒

5、載體示意圖,是第一個基因克隆載體。缺點：它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質粒，平均每個寄主細胞僅有12個拷貝，從帶有該質粒的寄主細胞中提取pSC101 DNA，產量很低,2、ColE1質粒載體 松弛型復制控制的多拷貝質粒。 一般情況下，當培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停止。 松弛型質粒DNA卻繼續(xù)復制數小時，使每個寄主細胞中ColE1質粒的拷貝數達到10003000個，占細胞總DNA的50%左右,ColE1質粒DNA復制起始部位調控因子之間關系,前體RNA(RNAII)的轉錄起始于復制起點上游，需經RNase

6、H加工后產生有555個核苷酸的引物，起始DNA合成。 RNA 1在RNA 2的5末端，轉錄方向相反，因此能通過氫鍵配對與后者相互作用，阻止RNaseH加工RNA 2，使其不能轉化為有活性的引物，阻礙復制起始。 沒有Rop蛋白，RNA 1基因就不能起始轉錄,3、pBR322質粒載體 由三個不同來源的部分組成的： 第一部分來源于pSF2124質粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）； 第二部分來源于pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）； 第三部分則來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori,Ampr,pBR322 4.36 kb,優(yōu)點是具有較小的分子量（4363 b

7、p）。能攜帶6-8 kb的外源DNA片段，操作較為便利。 有兩種抗生素抗性基因作為轉化子的選擇標記。 有較高的拷貝數，經過氯霉素擴增，每個細胞可累積10003000個拷貝，便于制備重組體DNA,4、pUC質粒載體（包括四個部分）： 來自pBR322質粒的復制起點（ori） 氨芐青霉素抗性基因（ampr） 大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）啟動子及編碼-肽鏈的DNA序列。特稱為lacZ基因 位于lacZ基因5-端的一段多克隆位點（MCS），外源基因插入破壞lacZ 基因功能,pUC18 2.69 kb,LacZ編碼-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的-肽，IPTG（異丙基- -D-硫代半乳糖苷）誘

8、導該基因表達，所合成的-半乳糖苷酶-肽與宿主細胞編碼的缺陷型-半乳糖苷酶互補，產生有活性的-半乳糖苷酶，水解培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲哚。 含X-gal培養(yǎng)基中非轉化菌落呈藍色，含有重組DNA分子的菌落為白色,優(yōu)點： 更小的分子量和更高的拷貝數。在pBR322基礎上構建pUC質粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop基因，pUC質粒不經氯霉素擴增時，平均每個細胞即可達500700個拷貝,pUC質粒結構中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所

9、編碼的-肽鏈可參與-互補作用。因此，可用X-gal顯色法實現對重組體轉化子的鑒定。 具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質粒載體上,5、 pGEM-3Z質粒 長度為2743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ基因。 含有兩個噬菌體啟動子(T7和SP6)，為RNA聚合酶的附著提供了特異性識別位點。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會轉錄出相應的mRNA,6、穿梭質粒載體（shuttle plasmid vector） 由人工構建的具有原核和真核兩種不同復制起點和選擇標記，可在不同的寄主細胞內存

10、活和復制的質粒載體。 這類質粒載體可保證外源DNA序列在不同物種(原核和真核)的細胞內得到擴增，用途廣泛,7、pBluescript噬菌粒載體 pBluescript是一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/,SK表示多克隆位點區(qū)的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向轉錄； （+/ -）表示單鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取向。 f1（+）起點表示當pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細胞時，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點則表

11、示當pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收到lacZ基因的無意義鏈DNA,i)在多克隆位點區(qū)（MCS）的兩側，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉錄； (ii)具有單鏈噬菌體f1的復制起點和一個來自ColE1質粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有無輔助噬菌體共感染時，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA,iii）編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉化子克隆的選擇標記； (iv)含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子,5. 2 DNA操作技術 5. 2.

12、 1核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段,一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當的電極。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比，與片段大小成反比,生理條件下，核酸分子中的磷酸基團呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場中向正電極的方向遷移。 由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量

13、的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移,瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間。 聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個堿基對之間。 凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強,表5-3 瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力 凝膠類型及濃度 分離DNA的大小范圍（bp） 0.3%瓊脂糖 50 0001 000 0.7%瓊脂糖 20 0001 000 1.4%瓊脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺 501,溴化乙錠染料的化學結構及其

14、對DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現出橘黃色熒光，易于鑒定,DNA脈沖電場凝膠電泳示意圖,5. 2. 2 細菌轉化與目標DNA分子的增殖 獲得了用外源DNA片段和載體分子重組而成的雜種DNA分子后，還必須通過一個被稱為細菌轉化的過程將其重新導入到寄主細胞中，才能保證重組DNA分子的增殖。 外源DNA能在宿主細胞中通過自身載體上的復制起始位點進行復制增殖，從而在宿主細胞中長期保存，并以完整的形式從細胞中被分離純化出來,細菌轉化（transformation），是指一種細菌菌株由于捕獲了來自供體菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過

15、程,重組DNA操作過程示意圖,為提高效率，可對受體菌進行物理或化學處理，增加其獲取DNA的能力。經過這種處理的細胞被稱作感受態(tài)細胞（competent cells,CaCl2法 將快速生長期大腸桿菌置于經0預處理的低滲CaCl2溶液中，細胞膨脹，膜通透性改變，易與外源DNA相粘附。 將該體系轉移到42下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細胞吸收。將經過轉化后的細胞置于選擇性培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。 轉化效率可達到51062107個轉化子/g超螺旋質粒DNA,細菌轉化及藍白斑篩選,電擊法 電脈沖可以在細胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會轉變?yōu)橛H水性孔洞，介質中的DN

16、A進入細胞質。 將生長至對數中期的E. coli菌液冷卻至4后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（21010/ml）置于特制的電極杯中進行電擊,獲得最大轉化效率時場強一般為12.515kV/cm，時間跨度一般為4.55.5毫秒。 電擊轉化與溫度有關，一般在04進行。由于轉化載體上常帶有LacZ基因，多用帶有不同抗生素的選擇性培養(yǎng)基結合-互補藍白斑篩選法鑒定轉化細胞,利用噬菌體顆粒能夠有效地將DNA注入到寄主細胞中這一特點，科學家還發(fā)明了重組體DNA分子的體外包裝法。經包裝的基因工程噬菌體顆粒能夠借助細菌表面的噬菌體接受器位點將DNA注入受體細菌，并在這些細胞中得到繁殖和表達,5. 2

17、. 3聚合酶鏈式反應（PCR）技術 聚合酶鏈式反應是快速擴增DNA序列最常用的方法。 PCR反應的模板DNA若是基因組上的某個片段，就稱為genomic PCR，若是mRNA反轉錄產生的cDNA，就稱為RT-PCR,圖5-7 聚合酶鏈式反應（PCR）技術,圖5-8 PCR指數擴增時循環(huán)次數與DNA產物數量的比較,1989年12月， 著名的自然科學雜志“SCIENCE”將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。 主編Daniel Koshland Jr. 寫道：第一篇有關PCR的論文發(fā)表于1985年。自那以后，PCR已經發(fā)展成為日益強大的和有廣泛用途的技術。 有了PCR，極少量遺傳物質

18、也能擴增產生大量一般實驗室都能得到的、可用于生化分析和鑒定的材料,SCIENCE”確實在1985年發(fā)表了第一篇關于PCR的論文。但是，卻拒絕了由穆利斯撰寫的描述PCR技術的論文。編輯部給他回了一封標準的拒稿信： “這篇文章雖然通過了評審委員會的初選，但不幸的是，專家們對本文的評審結論并沒有像對同時期擬錄用的稿件那樣積極。所以，尊稿無力競爭本刊有限的版面。,凱利穆利斯（Kary Mullis），1944年出生，1962年在佐治亞理工學院化學工程專業(yè)畢業(yè). 受同學們的蠱惑，1966年報考加州伯克利大學生化專業(yè)研究生被錄取。 1968年一個人在NATURE發(fā)表“時間反演的宇宙學意義”論文并僥幸通過了

19、博士生資格考試。 1972年，以“微生物鐵轉運因子的結構與有機合成”獲得博士學位,畢業(yè)后，嘗試寫小說，但因“不能使一部分人物具有不幸的遭遇”而失敗，又因厭惡天天宰殺實驗小鼠而兩次丟掉工作,他有一條知名的可能引起不少同學共鳴的學習曲線：剛開始時，對拓寬自身知識面表現出極大的興趣知識迅速上升，然后徘徊不前，最終進入失望和不安階段辭職 以后去一家小咖啡館當了兩年經理。1979年加入西特斯公司，負責DNA合成。 正是費時費力的DNA合成（單引物，以算術級數增長），激發(fā)了他的思維,1983年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一個有關PCR原理的學術報告。人們對這個報告的反應冷談，只有少數幾個實驗技術人員有

20、些興趣。穆利斯回憶說，“絕大多數人要么在我結束報告之前就離開了會場，要么故意留下來給我出難題。他們認為這些肯定是胡說八道。” 普遍的觀點是，雖然我不夠聰明，沒看出問題的要害，但肯定有理由證明這個方法不行，要不為什么從前沒人想到呢,PCR技術的原理 首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸、合適的Mg2+濃度和實驗中提供的引物序列合成新生的DNA分子,DNA解鏈（變性） 引物與模板DNA相結合（退火） DNA合成（鏈的延伸）三步。 經不斷重復循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數，即兩條引物結

21、合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數，理論上的最高值應是2n,實得1.8n,將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（94）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA,94加熱，變性（也叫淬火,降低反應溫度（退火，約50），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上,5060，退火 引物與模板DNA相結合,將反應混合物的溫度上升到72左右保溫1-數分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互補鏈,PCR擴增，72左右, 按每 分鐘1000個堿基對設計,循環(huán)往復,實驗中通過對擬南芥

22、基因芯片數據分析, 鑒定出一個受干旱脅迫誘導的cDNA。干旱、紫外線、脫落酸、高鹽以及水楊酸等脅迫條件處理后表達量均有顯著提高, 特別是干旱處理3h后表達量極顯著提高,多序列比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現該基因含有典型的AP2/EREBP DNA結合結構域，且屬于DREB亞家族。由于其N端富含谷氨酰氨殘基, 將它命名為QRAP2 (Glutamine-rich AP2,5. 2. 4 實時定量PCR （real time quantitative PCR，Q-PCR） 由于PCR敏感性高，擴增產物總量變異系數大，定量不準確。90年代末期出現了Q-PCR，利用熒光檢測PCR儀繪制DNA擴增過程中的累積速

23、率動態(tài)變化圖，基本消除在測定終端產物豐度時變異系數較大的問題,混合在PCR反應液中的熒光探針只有與大片段DNA結合后，才能夠被激發(fā)出熒光。 隨著新合成DNA片段的增加，由于結合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產生的熒光相應增加。 非序列特異性熒光染料SYBR Green I, 激發(fā)光波長520nm,SYBR Green I作探針的實時定量PCR實驗過程圖示,Ct值是產物熒光強度首次超過設定閾值時，PCR反應所需的循環(huán)數。利用標準曲線，可以確定樣品中待檢測靶DNA的絕對含量,圖5-11用實時定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對量,線性范圍的確定,為確保熒光檢測的確實是靶DNA，又設計了僅能與目的

24、DNA特異結合的熒光探針。 TaqMan探針是一段與靶DNA序列中間部位結合的單鏈DNA，長50bp-150bp，該DNA的5和3端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團，由于彼此距離靠近，在熒光共振能量轉移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測不到熒光,隨著PCR反應的進行，TaqMan 探針結合到目的DNA序列上，并且會被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐個切除而降解。切下來的熒光基團解除了熒光淬滅的束縛，會在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此，產生的熒光強度直接反映了所擴增靶DNA的總量,TaqMan探針實時定量PCR技術,表5-3 實時定量PCR相對定量實驗的數據處理,擬南芥野生型和突變體樣品經

25、由擬南芥持家基因（UBQ10）進行均一化處理,5. 2. 5 重亞硫酸鹽測序技術（Bisulfite Sequencing） DNA分子上可能發(fā)生多種化學修飾，如甲基化、乙酰化等。在不改變DNA序列的情況下，通過對DNA分子的化學修飾，可以改變基因表達水平。相對于傳統(tǒng)的遺傳學即只有DNA序列變化才能導致基因表達的改變而言，這種現象被稱為表觀遺傳學（Epigenetics,主要實驗過程： 將待測DNA樣品用限制性內切酶處理或超聲波破碎等物理方法打斷成5001000 bp的碎片， 重亞硫酸鹽處理使DNA中未甲基化的胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶，PCR擴增后被測序儀讀為胸腺嘧啶。 已甲基化的胞嘧啶由于甲基

26、的保護而不受影響。 參考原始序列判定原C位點是否甲基化未甲基化的C位點變?yōu)門，甲基化的C位點仍保持為C,重亞硫酸鹽測序(bisulfite sequencing,因為沒有甲基保護的C在重亞硫酸鹽處理后轉變?yōu)閁，引物設計時要將該位點相應改為T。 由于DNA上的C位點通常不是百分之百甲基化或非甲基化，所以合成引物時要用簡并位點，正向引物中為Y (Y=C或T)，反向引物中記做R (R=G或A)。 重亞硫酸鹽測序分析時，必須對同一目標片段進行多次測序，通常要求至少測序11次，以避免產生同源測序（sibling sequencing,5. 2. 6 基因組DNA文庫構建 把某種生物的基因組DNA切成適當

27、大小，分別與載體組合，導入微生物細胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€序列至少有一個代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫,可用Clark和Carbon公式預測一個完整基因組文庫應包含的克隆數目： N=ln(1-p) / ln(1-f) N表示一個基因組文庫所應該包含的重組克隆數目 p 表示所期望的靶基因在文庫中出現的概率 f表示重組克隆平均插入長度與基因組DNA總長之比。 以人為例，其基因組大小為3109 bp，若要求p = 99%，平均插入片段大小為20 kb，則N = 6.9105,構建基因組文庫最常用的是噬菌體載體（克隆能力約1520kb）和限制性

28、內切酶部分消化法。例如用識別4個核苷酸的核酸限制性內切酶Sau3A，與BamHI是一對同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產生的DNA片段可插入到經BamHI消化的噬菌體載體上,圖5-13 用Sau3A限制性核酸內切酶消化真核生物基因組DNA并利用噬菌體載體構建基因組文庫的過程圖示,噬菌體作為克隆載體的體外包裝過程,此外，還有很多大容量克隆載體，如柯斯質粒、細菌人工染色體（BAC）、P1源人工染色體（PAC）、酵母人工染色體（YAC）等都可用于基因組文庫的構建。 它們的優(yōu)點是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性一般較差，在大量復制的過程中容易出現缺失現象。操作也相對較困難,5. 3 RNA基本操作

29、技術 真核生物基因組DNA龐大，有大量重復序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來自反轉錄的mRNA，無冗余序列，通過篩選cDNA文庫，可較快地分離到相關基因,細胞中的總RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。 一個典型的動物細胞約含10-5g RNA，其中： 80%-85%為rRNA 15%-20%為tRNA及sRNA mRNA約占總RNA 的1%-5,rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數,圖5-14 PolyATtract mRNA的分離純化過程簡圖,RNA的濃度和純度可以通過測定

30、其OD260和OD280 來判斷。OD260為1時相當于濃度為40g/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質或酚污染，則OD260/ OD280的比值將明顯低于1.8,由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我復制的載體中,圖5-15 cDNA合成過程示意圖,圖5-16 定向cDNA 合成及分子修飾,因為絕大多數大腸桿菌細胞都會切除帶有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以實驗中常選用mc

31、rA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解,cDNA文庫的構建 cDNA的長度一般在0.5-8 kb之間，質粒載體和噬菌體類載體都能滿足要求。 cDNA文庫常用Uni-zap XR（一種噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質粒載體系統(tǒng)利用藍白斑篩選的便利，可容納0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。 重組后可通過體內剪切反應（In Vivo Excision）將cDNA插入片段轉移到質粒系統(tǒng)中進行篩選、克隆和序列分析,基因文庫的篩選 基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選的方法有很多種，如核酸雜

32、交法，PCR篩選法和免疫篩選法等,核酸雜交法： 核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫篩選中最常用的一種方法，用放射性標記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。 將待篩選菌落轉移到硝酸纖維素膜上，適當溫育。同時保留原來的菌落平板作對照,圖 5-17 通過核酸雜交篩選目的克隆流程圖,取出已經長有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質，形成菌落DNA的印跡。 80烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標記的DNA或RNA探針雜交，通過放射性自顯影顯示雜交結果。通過對應于平板上的位置找到相應克隆,PCR篩選法 將整個文庫（以質粒

33、的形式或者細菌的形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設計好的目的基因探針對每個孔進行PCR篩選，鑒定出陽性的孔，把每個陽性孔中的克隆再稀釋到次級多孔板中進行PCR篩選。重復以上程序，直到鑒定出與目的基因對應的單個克隆為止,免疫篩選法 該法僅適用于對表達文庫的篩選。若實驗中靶基因的序列完全未知但是有針對該基因產物的特異性抗體，就可以采用免疫篩選法,圖5-18 噬菌體表達文庫的免疫化學篩選法示意圖,5. 4 基因克?。╟lone）技術 在多細胞的高等生物個體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便是屬

34、于同一克隆,在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitor cell）分裂而來的一群帶有完全相同遺傳物質的子細胞。 在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆,5. 4 RACE技術 Rapid amplification of cDNA ends 在已知cDNA序列基礎上克隆5或3端缺失序列的技術。根據已知序列設計基因片段內部特異引物，由該片段向外側進行PCR擴增得到目的序列。 用于擴增5端的方法稱為5RACE，用于擴增3端的稱為3RACE,5 RACE 在反轉錄酶的作用下，以基因片段內部特異性引物（GSP1）啟始

35、cDNA第一條鏈合成。 RNase降解模板鏈mRNA，純化第一鏈。 用末端轉移酶在cDNA鏈3端加入連續(xù)的dCTP。 以連有oligo(dG) 的錨定引物和基因片段內部特異的nested引物進行PCR擴增，得到目的片段，用nest PCR檢測,3RACE 1、用oligo(dT)錨定引物啟始cDNA第一鏈的合成. 2、降解模板mRNA. 3、用通用錨定引物UAP和基因片段內部特異引物進行PCR擴增得到目的3片段，用nest PCR法檢測,除了獲得全長cDNA之外，RACE技術還被用于獲得5和3端非轉錄序列，研究轉錄起始位點的不均一性，研究啟動子區(qū)的保守性等,5. 4. 2 cDNA差示分析法

36、(RDA, Representation Difference Analysis) 通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片段。 4堿基切割酶處理Tester和Driver，形成平均為256 bp的代表群，保留了絕大部分遺傳信息。 每次T減D反應后僅設置72復性與延伸，94變性這兩個參數共20個PCR循環(huán)，PCR產物的特異性和所得探針的純度高,5. 4. 3 Gateway大規(guī)?？寺〖夹g Gateway技術利用噬菌體進行位點特異性DNA片段重組，實現了不需要傳統(tǒng)的酶切聯(lián)接過程的基因快速克隆和載體間平行轉移,Gateway大規(guī)?？寺〔呗?TOPO反應: 將目的

37、基因PCR產物連入Entry載體。載體上的CCCTT被拓撲異構酶所識別，通過與切口處的磷酸基團形成共價鍵，將該酶偶聯(lián)在載體上。5GTGG粘性末端攻擊PCR產物的互補性末端并與接頭序列CACC退火，使PCR產物以正確方向連入Entry載體,LR反應： 將目的片段從Entry 載體中重組入表達載體。Entry載體上基因兩端具有attL1和attL2位點，目的載體上含有attR1和attR2位點，在重組蛋白的作用下發(fā)生定向重組，形成新的位點attB1和attB2，將目的基因轉移到表達載體中,Get Entry Vector,Get Expression Vector,Get cDNA,120 AP2

38、/EREBP genes were cloned,5. 4. 4 基因的圖位克隆法 (Map-based cloning) 所有具有某種表現型的基因都可以通過該方法克隆得到。 通過構建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記,通過對不同的生態(tài)型及限制性內切酶和雜交探針的分析，找出與目的基因距離最近的分子標記，通過染色體步移法將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來，根據基因功能互作原理鑒定目的基因,圖5-26 染色體步移法克隆基因示意圖,在RFLP作圖中，連鎖距離是根據重組率來計算的，1cM（厘摩）相當于1%的重組率。人類基因組中

39、，1cM1000kb；擬南芥菜中，1cM290kb；小麥中，1cM3500kb,用圖位克隆法獲得水稻脆桿基因BCL,將BCL定位于水稻3號染色體（Chr3）分子標記C524a和RM16之間； B. 覆蓋BCL位點的BAC大片段。 C. BCL位點的精細定位。BCL位點被定位于分子標記P2和P4之間與P3共分離。 D. BCL基因結構。紅色為編碼區(qū)，白色為5和3非翻譯區(qū)，黑色線段為內含子。bcl-1和bcl-2表示兩個突變位點,5. 4. 5 熱不對稱交錯多聚酶鏈式反應克隆T-DNA插入位點側翼序列 TAIL-PCR：Thermal Asymmetric Inter-Laced PCR,常規(guī)PC

40、R技術能擴增兩引物之間的DNA區(qū)段，然而，有時我們也希望擴增位于靶DNA區(qū)段之外的未知DNA序列，這就需要應用反向PCR（reverse PCR）技術,用一種在靶序列上沒有酶切位點的核酸限制性內切酶消化DNA； 產生大小不同的線性DNA片段群體，其中靶DNA區(qū)段的DNA分子長度不超過23kb，經連接后重新環(huán)化； 按靶序列設計的一對引物與互補序列退火結合，其延伸方向如箭頭所指,反向PCR的基本操作程序。波紋線表示靶DNA區(qū)段，箭頭表示限制性內切酶位點，分別用方框表示靶DNA區(qū)段的左側和右側序列,實驗中常用熱不對稱交錯多聚酶鏈式反應（TAIL-PCR：Thermal Asymmetric Inte

41、r-Laced PCR）擴增T-DNA插入位點側翼序列，獲得轉基因植物插入位點特異性分子證據,TAIL-PCR使用一套巢式（nested）特異引物（T-DNA邊界引物，TR）和一個短的隨機簡并引物（AD）。 第一輪反應（Primary reaction）是TAIL-PCR的重要環(huán)節(jié)，先進行5輪高嚴謹性循環(huán)，特異性引物與模板退火，只能發(fā)生單引物循環(huán)，T-DNA上游側翼序列得到線性擴增,大幅度降低退火溫度，使AD及TR均與模板DNA相結合，指數擴增一個循環(huán)。 此后，兩個高嚴謹、一個低嚴謹循環(huán)交替進行（PCRII），共15個循環(huán)。特異性序列（兩端分別擁有TR1和AD序列）和非特異性序列I（只有TR1，沒有AD序列）大大超過非特異性序列II （兩端均為AD序列,PCRII中，特異性序列再次被優(yōu)先擴增，經稀釋的非特異性序列I也已大為降低，此時已沒有明顯的背景片段了。 PCRIII是真正意義上的PCR，共20個循環(huán)，進一步擴增特異性序列,5. 5 蛋白質與蛋白質組學技術 蛋白質組學是蛋白質（protein）和基因組（genome）研究在形式和內容兩方面的結合，該技術致力于研究某一物