基因測(cè)序原理ppt課件

1、第一講 基因組測(cè)序與序列組裝,任科教師: 余愛麗 生命科學(xué)院 分子生物學(xué)與生物信息學(xué)系,主要內(nèi)容: 什么是基因組 什么是基因 DNA測(cè)序的方法 DNA序列的組裝 人類基因組計(jì)劃 水稻基因組計(jì)劃 后基因組學(xué),1. 什么是基因組,基因組就是一個(gè)物種中所有基因的整體組成。 基因組有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。 要揭開生命的奧秘，就需要從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系,Zea mays 8,000 Homo sapiens 3,000 Oryza sativa 400 Drosophila melanogaster 165 Arabidopsis thaliana 10

2、0 Saccharomyces cerevisiae 12 E.coli 4.6,Genome Size (Mb,什么是C 值？ 通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量,在真核生物中，C值一般隨著生物的進(jìn)化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。 C值悖理： 生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加,陰影部分為一個(gè)門內(nèi)C-值的范圍,重復(fù)順序,高度重復(fù)順序： 長(zhǎng)度：幾個(gè)幾千個(gè)bp 拷貝數(shù)：幾百個(gè)上百萬(wàn)個(gè) 首尾相連，串聯(lián)排列 集中分布于染色體的特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等） 也稱衛(wèi)星DNA 中度重復(fù)順序： 一般分散于整個(gè)基因組中； 長(zhǎng)度和拷貝數(shù)差別很大 單一順序： 基因主要位于單一順序 動(dòng)物中單

3、一順序約占50 植物中單一順序約占20,DNA 的復(fù)性 遵循二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，可表述為,dCt / dt = -KC02,反應(yīng)達(dá) t 時(shí)，單鏈DNA濃度 = Ct,C0 = 單鏈 DNA起始濃度 K 復(fù)性速度常數(shù),順序復(fù)雜性,Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 常數(shù),Ct/C0,0,1,0,1,C0t(1/2) C0t(1/2,C0t(1/2)值與基因組復(fù)雜性成正比,是遺傳信息的物理和功能單位，包含產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 基因分類： 編碼RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等； 編碼蛋白質(zhì)的基因,2. 什么是基因,基因的不連續(xù)性,Int

4、ron 和Exon: 大多數(shù)真核生物蛋白質(zhì)基因的編碼順序(Exon)都被或長(zhǎng)或短的非編碼順序(Intron)隔開,基因家族,一群具有一致的或相似順序的基因,有的還擔(dān)負(fù)類似的生物學(xué)功能, 可以相互補(bǔ)償, 比如:E2f transcription factor,假基因(Pseudogene,來(lái)源于功能基因 但已失去活性 的DNA序列 產(chǎn)生假基因的原因有: 由重復(fù)產(chǎn)生的假基因; 加工的假基因, 由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后再整合到基因組中; 殘缺的基因(Truncated gene,重疊基因: 同一段DNA 能攜帶兩種不同蛋白的信息,重迭基因有以下幾種情況： *一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部 *部分重

5、疊 * 兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對(duì),一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部 如：B和A， E和D 其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同,部分重疊 如： K和C *兩個(gè)基因共用少數(shù) 堿基對(duì) 如： D和J,TAATG,D 終止密碼子,J 起始密碼子,3. DNA測(cè)序的方法 鏈終止法測(cè)序 化學(xué)降解法測(cè)序 自動(dòng)化測(cè)序 非常規(guī)DNA測(cè)序,3.1 鏈終止法測(cè)序(the chain termination method) 基本原理: 通過(guò)合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來(lái)讀取待測(cè)DNA分子的順序,技術(shù)路線與要求,制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入D

6、NA多聚酶 4種脫氧核苷酸 分別加入少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳 根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列,A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性 B M13克隆單鏈DNA C 噬?？寺NA D PCR產(chǎn)生單鏈DNA,A 高酶活性 B 無(wú)53外切酶活性 C 無(wú)35外切酶活性,ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基,3.2 化學(xué)降解法測(cè)序 基本原理: 在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)集團(tuán),再用化合物處理,使DNA分子在被修飾的位置降解,技術(shù)路線,將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂?每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA

7、條帶 分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體 電泳,讀取DNA的核苷酸順序,Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù),化學(xué)法測(cè)序?qū)嵗?哌啶,3.3 自動(dòng)化測(cè)序,基本原理 與鏈終止法測(cè)序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光, ddGTP標(biāo)記黃色熒光, ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基,3.4 非常規(guī)測(cè)序 毛細(xì)管電泳 用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳,節(jié)省時(shí)間,加快測(cè)序進(jìn)程,其他程序同鏈終止法或化學(xué)測(cè)序法. 光點(diǎn)測(cè)序 脫氧三磷酸核苷酸連接到DNA 3-

8、末端時(shí)會(huì)釋放1個(gè)焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,并發(fā)出光亮.由此,往反應(yīng)液中每次只加入1種核苷酸,當(dāng)加入的核苷酸結(jié)合時(shí),反應(yīng)液發(fā)出亮點(diǎn),并記錄核苷酸種類;當(dāng)核苷酸未結(jié)合時(shí),反應(yīng)液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此來(lái)測(cè)定DNA序列,DNA芯片測(cè)序 基本原理 將各種排列順序的寡核苷酸點(diǎn)播在芯片上, 每個(gè)點(diǎn)播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測(cè)的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會(huì)在確定位置發(fā)出信號(hào),然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進(jìn)行對(duì)比組裝,拼接成完全的DNA順序,利用基因芯片進(jìn)行雜交測(cè)序的原理,4 序列的組裝,4.1 隨機(jī)測(cè)序與序列組裝 隨機(jī)測(cè)序

9、也稱”鳥槍法”. 序列組裝原理:直接從已測(cè)序的小片段中尋找彼此重疊的測(cè)序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸. 優(yōu)點(diǎn):不需預(yù)先了解任何基因組的情況,A,B,C,A,B,C,A,B,C,A,B,C,小片段測(cè)序,計(jì)算機(jī)拼裝,A,B,C,小片段測(cè)序,計(jì)算機(jī)拼裝,鳥槍法(Shotgun)測(cè)序的問(wèn)題,CAATGCATTA GCAGCCAATGC,GAP,錯(cuò)裝,實(shí)例:流感嗜血桿菌基因組的測(cè)序及順序組裝,超聲波打斷純化的基因組DNA 瓊脂糖電泳收集1.62.0Kb的區(qū)段、純化 構(gòu)建到質(zhì)粒載體中 隨機(jī)挑選19687個(gè)克隆,進(jìn)行28643次測(cè)序,得到可讀順序?yàn)?1 631 485 bp 組裝成140個(gè)覆蓋全基因組

10、范圍的獨(dú)立的順序重疊群,各重疊群間仍有間隙 順序間隙 物理間隙,載體或宿主菌 選用不當(dāng)而被丟失的順序,測(cè)序時(shí)遺漏的測(cè)序,解決辦法:通過(guò)相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫(kù),解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫(kù),4.2 限制測(cè)序,限制測(cè)序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA 順序進(jìn)行組裝. 一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測(cè)序中也采用這一方法. 如高等植物擬南芥基因組的測(cè)序完全依據(jù)克隆重疊群,先進(jìn)行各個(gè)BAC克隆的隨機(jī)測(cè)序,再進(jìn)行序列組裝； 水稻基因組測(cè)序計(jì)劃采取得策略與此相同,4.3 指導(dǎo)測(cè)序與序列組裝,建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥槍法”或”指導(dǎo)測(cè)序”。 在人

11、類基因組進(jìn)入測(cè)序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下: A 構(gòu)建平均為2Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫(kù),進(jìn)行雙向測(cè)序; B 構(gòu)建平均10Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫(kù),進(jìn)行雙向測(cè)序,讀取2個(gè)端部順序; C 參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標(biāo)作為基點(diǎn),進(jìn)行序列組裝，排成重疊克隆群,先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb), 利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig), 分別測(cè)序后拼裝. 這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略,A,B,C,A,B,C,大片段contig,小片段測(cè)序拼裝,兩種策略的比較,鳥槍法策略 指導(dǎo)測(cè)序策略 不需背景信息 構(gòu)建克隆群 (遺傳、物理圖譜

12、) 時(shí)間短 需要幾年的時(shí)間 需要大型計(jì)算機(jī) 得到的是草圖(Draft) 得到精細(xì)圖譜,4.5 其他測(cè)序路線,重要區(qū)域優(yōu)先測(cè)序 人們對(duì)感興趣的基因或與疾病相關(guān)的基因優(yōu)先測(cè)序. 如:人類主要組織相容性復(fù)合區(qū)位于第6號(hào)染色體,與人類免疫系統(tǒng)有關(guān)，因而優(yōu)先測(cè)序,EST (Expressed sequence tag) 測(cè)序 EST是一種重要的基因組圖分子標(biāo)記,以EST為探針很容易從 cDNA文庫(kù)中篩選全基因,又可從BAC克隆中找到其基因組的基因序列. 優(yōu)點(diǎn): A mRNA 可直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA,而且cDNA文庫(kù)也比較容易構(gòu)建; B 對(duì)cDNA文庫(kù)大量測(cè)序,即可獲得大量EST的序列; C EST為基因

13、的編碼區(qū),不包括內(nèi)含子和基因間區(qū)域,一次測(cè)序的結(jié)果足以鑒定所代表的基因,5.人類基因組計(jì)劃,人類基因組計(jì)劃（Human genome project）于1990年啟動(dòng)，我國(guó)于1999年加入該計(jì)劃，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號(hào)染色體短臂上約30Mb的測(cè)序任務(wù),5.1 人類基因組計(jì)劃的目的,闡明人類基因組30億個(gè)堿基對(duì)的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因，并搞清其在染色體上的位置; 破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我; 解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律; 認(rèn)識(shí)種屬之間和個(gè)體之間存在差異的起因、認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的機(jī)制以及長(zhǎng)壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù),5

14、.2 人類基因組草圖的完成,2000年6月26日是人類歷史上值得紀(jì)念的一天。人類基因組的工作草圖已經(jīng)繪制完畢并于這天向全世界公布。最終完成圖要求測(cè)序所用的克隆能忠實(shí)地代表常染色體的基因組結(jié)構(gòu)，序列錯(cuò)誤率低于萬(wàn)分之一,A. Celera Genomics 人類基因組的測(cè)序策略,5.3 人類基因組測(cè)序策略,采集5個(gè)自愿者的DNA樣品,構(gòu)建3種不同插入子大小的基因組文庫(kù)2Kb, 10Kb和50Kb,完成約2700萬(wàn)次插入子末端測(cè)序,總長(zhǎng)14800Mb,GeneBank下載104018個(gè)BAC末端順序,PFP發(fā)表的公開數(shù)據(jù)主要為BAC克隆的順序,共4443.3Mb,隨機(jī)測(cè)序與序列組裝方法和 指導(dǎo)測(cè)序與

15、序列組裝方法 相結(jié)合進(jìn)行序列組裝,B 國(guó)際人類基因組測(cè)序策略 構(gòu)建BAC克隆 限制性酶處理獲得指紋 根據(jù)指紋重疊方法組建BAC克隆重疊群 根據(jù)STS標(biāo)記,將BAC克隆重疊群標(biāo)定在物理圖上 每個(gè)BAC克隆內(nèi)部采用鳥槍法測(cè)序,組裝 將BAC插入順序與BAC克隆指紋極重疊群對(duì)比,將已閱讀的順序錨定到物理圖上,5.4 人類基因組測(cè)序結(jié)果,基因數(shù)是3萬(wàn)、4萬(wàn)還是10萬(wàn) 人類遺傳基因數(shù)量比原先估計(jì)的少很多。目前研究表明，人類基因組中約有3萬(wàn)至4萬(wàn)個(gè)蛋白編碼基因，僅僅是果蠅基因數(shù)目的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個(gè)。此結(jié)論是由兩大科研小組的數(shù)據(jù)是從DNA水平上得出的；而“人類有10萬(wàn)多個(gè)基因”則是從RN

16、A水平上得出的結(jié)論。所以，這些數(shù)據(jù)不能推翻“人類有10萬(wàn)個(gè)基因”的說(shuō)法,人類基因組研究的驚人發(fā)現(xiàn),19號(hào)染色體是含基因最豐富的染色體，而13號(hào)染色體含基因量最少 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能 人類基因組中存在“熱點(diǎn)”和大片“荒漠”。在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有“無(wú)用DNA” 不包含或含有極少基因的成分?；蚪M上大約有14的區(qū)域沒有基因的片段。 353的基因包含重復(fù)的序列。這說(shuō)明那些原來(lái)被認(rèn)為是“垃圾”的DNA也起重要作用，應(yīng)該被進(jìn)一步研究,什么是單核苷酸多態(tài)性,人類999的基因密碼是相同的，而差異不到01，不同人群僅有1

17、40萬(wàn)個(gè)核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SNP）產(chǎn)生的，它構(gòu)成了不同個(gè)體的遺傳基礎(chǔ)，個(gè)體的多樣性被認(rèn)為是產(chǎn)生遺傳疾病的原因。在整個(gè)基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬(wàn)分之一，從而說(shuō)明人類不同“種屬”之間并沒有本質(zhì)上的區(qū)別,5.5 人類基因組計(jì)劃的意義,隨著人類基因組逐漸被破譯，一張生命之圖將被繪就，人們的生活也將發(fā)生巨大變化。人類基因研究的意義在于它可以支持和推動(dòng)生命科學(xué)中一系列重要的基礎(chǔ)性研究。如基因組遺傳語(yǔ)言的破譯，基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，生命的起源和進(jìn)化，細(xì)胞發(fā)育、生產(chǎn)、分化的分子機(jī)理，疾病發(fā)生的機(jī)理等,5.6 人類基因組計(jì)劃的論理學(xué),A 個(gè)人DNA順序的隱私權(quán). 如:”次等

18、”基因攜帶者可能受到岐 視,職業(yè)限制,醫(yī)療保險(xiǎn)等問(wèn)題; B 基因?qū)＠麊?wèn)題,6. 后人類基因組計(jì)劃,伴隨著人類基因組計(jì)劃的迅速進(jìn)展，基因的全序列逐步被完整的測(cè)出，會(huì)出現(xiàn)大量的不知道任何功能信息的序列。因此，在HGP完成之后，即全部人類基因被定序之后，還需要： 破解貯存于基因組之中的遺傳語(yǔ)言; 識(shí)別、分離、鑒定和克隆所有基因； 搞清每個(gè)基因的功能及基因之間的相互作用和相互關(guān)系,7 水稻的基因組,2002年我國(guó)科學(xué)家完成了水稻基因組定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人類基因還要多得多。人類基因大約有3-4萬(wàn)個(gè)，水稻有46022-55615個(gè)基因。因此水稻基因組可說(shuō)是繼人類基因組之后，完成定

19、序的最大基因組，也是至今已知最大的植物基因組。由于水稻是全球半數(shù)以上人口的主食，對(duì)解決全球糧食問(wèn)題具有重要意義,本章要點(diǎn),鏈終止法測(cè)序 人類基因組計(jì)劃 了解其他基因測(cè)序方法和基因拼接方法,本章內(nèi)容結(jié)束謝謝,第二講 基因組序列詮釋,問(wèn)題,基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？ 基因組作為一個(gè)整體如何行使其功能？ 用什么方法尋找基因，研究基因地功能呢,主要內(nèi)容,尋找基因 獲取基因的全長(zhǎng)cDNA序列 確定DNA順序中基因的位置 研究基因的功能 基因表達(dá) 蛋白質(zhì)組學(xué),1. 尋找基因,1.1 根據(jù)開放讀碼框預(yù)測(cè)基因 A 起始密碼子 ATG 第一個(gè)ATG的確定則依據(jù)Kozak規(guī)則; Kozak規(guī)則是基于已

20、知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，所謂Kozak規(guī)則，即第一個(gè)ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律,若將第一個(gè)ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1,2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下： (1)第4位的偏好堿基為G； (2)ATG的5端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基； (4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基,信號(hào)肽分析 信號(hào)肽分析軟件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把預(yù)測(cè)過(guò)程中證實(shí)含完整mRNA 5端的Contig翻譯為蛋白序列; 然后用SignalP軟件對(duì)前50個(gè)氨基酸

21、序列(從第一個(gè)ATG對(duì)應(yīng)的甲硫氨酸Met開始)進(jìn)行評(píng)估，如果SignalP分析給出正面結(jié)果，則測(cè)試序列有可能為信號(hào)肽; 假如在該測(cè)試序列的第一個(gè)Met 5端存在終止密碼子，該序列為信號(hào)肽的可能性更大,B 終止密碼子 終止密碼子: TAA, TAG,TGA GC% = 50% 終止密碼子每 64 bp出現(xiàn)一次； GC% 50% 終止密碼子每100200 bp 出現(xiàn)一次； 由于多數(shù)基因 ORF 均多于50個(gè)密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是 ORF 不少于100 個(gè)密碼子,C 3端的確認(rèn) 3端的確認(rèn)主要根據(jù)Poly(A)尾序列,若測(cè)試Contig不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號(hào)序列“AATAAA

22、”和BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷,D 非編碼序列、內(nèi)含子 高等真核生物多數(shù)外顯子長(zhǎng)度不少于100 個(gè)密碼子，有的不到50個(gè)密碼子甚至更少,E 密碼子偏愛性 編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。 不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用,F 外顯子內(nèi)含子邊界 外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征，如： 內(nèi)含子的5端或稱供體位（donor site）常見的順序?yàn)?5AGGTTAAGT-3； 3端又稱受體位（acceptor site), 多為5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C,G 上游控制順序 幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。 另外個(gè)別生物的基因組特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動(dòng)物基因組許多基因的上游都有CpG島,H 軟件預(yù)測(cè) 采用NCBI的ORF預(yù)測(cè)軟件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判斷ORF的可能范圍,1.2 mRNA的5端即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū) 通過(guò)同源性比較來(lái)預(yù)測(cè)mRNA的5端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)是真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)(The TRADAT Project ,