病毒與細(xì)胞相互作用

1、第四章 病毒與細(xì)胞間的相互作用,第一節(jié) 病毒的培養(yǎng) 第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相互作用,第一節(jié) 病毒的培養(yǎng),病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物，培養(yǎng)病毒必須使用細(xì)胞。根據(jù)病毒的不同選用敏感動(dòng)物（動(dòng)物接種）、雞胚（雞胚接種）或離體細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物接種,接種后通常以動(dòng)物發(fā)病、死亡作為感染的指標(biāo),按病毒侵襲部位不同選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑。嗜神經(jīng)病毒接種在小鼠的腦內(nèi)。痘苗病毒和單純皰疹病毒接種于家兔角膜,雞胚接種,一種比較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法,一般采用孵化9-12天的雞胚，按病毒種類(lèi)不同接種于雞胚的不同部位,可采用絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔接種,人或動(dòng)物細(xì)胞在一定條件下可在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)。 優(yōu)點(diǎn)： 每

2、個(gè)細(xì)胞生理特性基本一致，對(duì)病毒易感性相等 無(wú)個(gè)體差異，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好 可嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作 細(xì)胞培養(yǎng)本身就能顯示病毒的生長(zhǎng)特征 應(yīng)用空斑技術(shù)可進(jìn)行病毒的克隆化,細(xì)胞培養(yǎng),原代細(xì)胞（primary cell） 動(dòng)物組織經(jīng)胰蛋白酶消化處理，使細(xì)胞分散而得到的細(xì)胞。 二倍體細(xì)胞株（diploid cell strain） 將長(zhǎng)成單層的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞，稱為二倍體細(xì)胞。 傳代細(xì)胞系（established cell line）能在體外持續(xù)增殖傳代的細(xì)胞，大多數(shù)由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突變而成,一）細(xì)胞的類(lèi)型,二）細(xì)胞培養(yǎng)的方法,

3、靜置培養(yǎng)（stationary culture） 實(shí)驗(yàn)室常用。細(xì)胞懸液裝瓶，5%CO2溫箱靜置培養(yǎng)，細(xì)胞沉降并貼附在玻面上生長(zhǎng)分裂，最后長(zhǎng)成單層。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)（roller culture） 大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。細(xì)胞在玻瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)時(shí)，玻瓶不斷緩慢旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞帖附于玻瓶四周，長(zhǎng)成單層,懸浮培養(yǎng)（suspensive culture） 通過(guò)攪拌使細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，并補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和校正pH，使之生長(zhǎng)或維持存活。 微載體培養(yǎng)（micro-carrier culture） 是在懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微載體的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。 微載體是直徑10035m的微小顆粒，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，細(xì)胞可貼附其上長(zhǎng)成單層,第二節(jié) 病毒與細(xì)胞的相

4、互作用,殺細(xì)胞感染 非殺細(xì)胞感染 引致持續(xù)感染，對(duì)細(xì)胞代謝無(wú)影響。 產(chǎn)生干擾素,生產(chǎn)性感染（productive），病毒感染后能產(chǎn)生和釋放子代病毒顆粒。宿主細(xì)胞感染病毒發(fā)生的變化可能是細(xì)胞死亡或細(xì)胞轉(zhuǎn)化 非生產(chǎn)性感染（nonproductive）或稱頓挫感染（abortive infection） 病毒感染后不形成完整的病毒顆粒 持續(xù)性感染（persistent infection）是指持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的感染，感染過(guò)程中不形成感染性的病毒顆粒,病毒與細(xì)胞的相互作用,一、病毒引致的殺細(xì)胞變化,細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE) 由病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。CPE能在光學(xué)顯微鏡下觀

5、察。常見(jiàn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化為細(xì)胞變圓、壞死、溶解、脫落或形成合胞體。有些病毒能形成包涵體,細(xì)胞腫大 細(xì)胞圓縮 形成合胞體 病毒所致的細(xì)胞病變,tissue culture cells,epithelial,epithelioid,fibroblastic,epithelial cells,uninfected,early infection,late infection,slides from CDC,fibroblastic cells,uninfected,early infection,late infection,slides from CDC,Formation of multinuc

6、leated cells,能夠使半數(shù)組織細(xì)胞在一定條件下發(fā)生細(xì)胞病變的病毒量。用于判定病毒的毒力,半數(shù)組織細(xì)胞感染量（tissue culture infectious dose 50, TCID50,涉及細(xì)胞膜的CPE 有囊膜的病毒出芽過(guò)程中能將其融合蛋白直接插入宿主細(xì)胞膜，結(jié)果導(dǎo)致膜融合以及合胞體（syncytia）形成。 慢病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、某些皰疹病毒等感染 涉及細(xì)胞骨架的CPE 微絲（如actin）、中介絲（如vimentin）及微管（如tubulin）等細(xì)胞骨架與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、物質(zhì)運(yùn)輸及運(yùn)動(dòng)性等有關(guān),病毒引致的細(xì)胞凋亡與壞死 壞死（necrosis）、 凋亡（a

7、poptosis,圖2432-2 感染犬瘟熱病毒凋亡的Vero細(xì)胞的電鏡照片,病毒感染抗體依賴的增強(qiáng)作用（Antibody-dependent enhancement of viral infection, ADE） 在病毒感染過(guò)程中，宿主產(chǎn)生的抗體與病毒結(jié)合，非但未能阻斷病毒吸附宿主細(xì)胞，反而增強(qiáng)了病毒對(duì)細(xì)胞的感染，提高了病毒的滴度,一）空斑試驗(yàn),將適當(dāng)濃度的病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)中，當(dāng)病毒吸附細(xì)胞后，再覆蓋一層融化的瓊脂。病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后產(chǎn)生局限性病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，肉眼也能看見(jiàn)，此即空斑(plaque,空斑是由一個(gè)感染性病毒粒子復(fù)制形成的，類(lèi)似于細(xì)菌的菌落，稱為空斑形成單位（PFU）

8、。病毒懸液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU來(lái)表示,空斑試驗(yàn)的用途,1. 測(cè)定病毒數(shù)量 2. 純化病毒 單個(gè)空斑作懸液，梯度稀釋后再作空斑，可獲得病毒克隆。 3. 鑒定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征,二）包涵體（inclusion body,定義：是某些病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的特征性的形態(tài)變化，在普通光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的呈嗜酸性或嗜堿性染色、大小數(shù)量不等的圓形或不規(guī)則形的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，稱為包涵體,圖324-4 皰疹病毒的包涵體,包涵體的性質(zhì),病毒成分的蓄積，如狂犬病毒的Negri氏體 大量晶格樣排列的病毒顆粒組成，如腺病毒的包涵體 細(xì)胞變性的產(chǎn)物，不含病毒，如皰疹病毒的包涵體,定義

9、：由病毒或誘生劑刺激機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的糖蛋白。 種類(lèi)：、干擾素。 抗病毒作用：干擾素不直接作用于病毒，而是作用于鄰近的細(xì)胞，使其產(chǎn)生抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制蛋白合成。 干擾素作用具有宿主特異性，而無(wú)病毒特異性,二、干擾素（IFN,干擾素抗病毒機(jī)制,RNA干擾（RNA interference, RNAi）指細(xì)胞利用內(nèi)源或外源的小分子雙股RNA片段，特異性地降解同源基因的mRNA，從而導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（post translational gene silence, PTGS）的現(xiàn)象,復(fù)習(xí)思考題,1. 細(xì)胞培養(yǎng)有何優(yōu)點(diǎn)？ 2. 原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞系的概念。 3. CPE、PFU、空斑、包涵體和干擾素的概念,第五章 病毒的致病機(jī)理,病毒的持續(xù)性感染 類(lèi)型,持續(xù)性感染（persistent infections） 不論是否發(fā)病，感染性病毒始終存在。 潛伏感染（latent infections） 又名隱性感染。除非激活，一般并不能發(fā)現(xiàn)感染性病毒