表觀遺傳學(xué)課件(2016

1、表觀遺傳學(xué) （epigenetics,Epigenetic differences：monozygotic twins,遺傳類型,1. 遺傳編碼信息： 提供生命必需蛋白質(zhì)的模板 2. 表觀遺傳學(xué)信息： 何時(shí)、何地、以何種方式去應(yīng)用遺傳信息,遺傳信息的傳遞：中心法則,1. DNA自身通過(guò)復(fù)制傳遞遺傳信息； 2. DNA轉(zhuǎn)錄成RNA； 3. RNA自身能夠復(fù)制 (RNA病毒)； 4. RNA能夠逆轉(zhuǎn)錄成DNA； 5. RNA翻譯成蛋白質(zhì),表觀遺傳學(xué)( epigenetics,1. 概念 基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。 2. 特征 (1)可遺傳

2、(2)可逆性 (3)DNA不變,8,8,遺傳與表觀遺傳,9,9,基因組與表觀基因組,1942 年沃丁頓 (Wadding ton) 在 Endeavour 雜志 首次提出表觀遺傳學(xué)。 基因型的遺傳(heredity)或傳承(inheritance)是遺傳學(xué)研究的主旨 ,而基因型產(chǎn)生表型的過(guò)程則是屬于表觀遺傳學(xué)研究的范疇,研究歷史,1987 年 ,霍利德( Holliday) 進(jìn)一步指出可在兩個(gè)層面上研究高等生物的基因?qū)傩浴?第一個(gè)層面是基因的世代間傳遞的規(guī)律 遺傳學(xué)。 第二個(gè)層面是生物從受精卵到成體的發(fā)育過(guò)程中基因活性變化的模式 表觀遺傳學(xué),表觀遺傳學(xué)研究 “上代向下代傳遞的信息 ,可以通過(guò)有

3、絲分裂或減數(shù)分裂而遺傳下去的基因功能的改變，而不是DNA 序列本身” ,這是一種 “不以 DNA序列差別為基礎(chǔ)的細(xì)胞核遺傳”,三個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)： DNA修飾 ：DNA共價(jià)結(jié)合一個(gè)修飾基團(tuán)，使具有相同序列的等位基因處于不同的修飾狀態(tài)。 蛋白修飾：通過(guò)對(duì)特殊蛋白修飾或改變蛋白的構(gòu)象實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。 非編碼RNA調(diào)控：通過(guò)某些機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，如RNA干擾。 意義： 任何一個(gè)層面異常，都將影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)，導(dǎo)致復(fù)雜綜合征、多因素疾病以及癌癥。和DNA序列改變不同的是，許多表觀遺傳的改變是可逆的，這就為疾病的治療提供樂(lè)觀的前景,表觀遺傳學(xué)的研究?jī)?nèi)容,基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控

4、DNA甲基化 基因印記 組蛋白共價(jià)修飾 染色質(zhì)重塑,基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控 基因組中非編碼RNA 微小RNA（miRNA） 反義RNA 內(nèi)含子、核糖開關(guān)等,14,表觀遺傳學(xué)機(jī)制,DNA 甲基化,1,14,Probst et al. Nat Rev 2009,2021年2月2日,16,一、DNA甲基化,2021年2月2日,DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是最重要的表觀遺傳修飾形式，主要是基因組 DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基間的共價(jià)結(jié)合，胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC,胞嘧啶甲基化反應(yīng),16,S-腺苷甲硫氨酸,DNA甲基化

5、轉(zhuǎn)移酶,DNMT1 作為DNA復(fù)制復(fù)合物的組分，催化子鏈DNA半甲基化位點(diǎn)甲基化，維持復(fù)制過(guò)程中甲基化位點(diǎn)的遺傳穩(wěn)定性。 DNMT3a和 DNMT3b 主要催化從頭甲基化，以非甲基化DNA為模板催化新的甲基化位點(diǎn)形成,基因調(diào)控模型,1. DNA甲基化的主要功能：轉(zhuǎn)錄沉默 (1) 基因的啟動(dòng)子區(qū)域通常不被甲基化修飾 (2) 建立特定的基因表達(dá)模式： 組織特異性、生殖特異性 (3) 基因組印記、X染色體失活 2. DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制： (1) 干擾轉(zhuǎn)錄因子對(duì)DNA元件的識(shí)別和結(jié)合 (2) 將轉(zhuǎn)錄因子DNA識(shí)別序列轉(zhuǎn)變?yōu)樽枰治镒R(shí)別序列 (3) DNA甲基化有利于招募染色質(zhì)重塑或修飾因子

6、3. DNA甲基化： 是轉(zhuǎn)錄沉默的結(jié)果和維持，而不是原因,19,一、DNA甲基化,哺乳動(dòng)物基因組中5mC占胞嘧啶總量的2%-7%，約70%的5mC存在于CpG二連核苷。 在結(jié)構(gòu)基因的5端調(diào)控區(qū)域, CpG二連核苷常常以成簇串聯(lián)形式排列，這種富含CpG二連核苷的區(qū)域稱為CpG島(CpG islands)，其大小為500-1000bp，約56%的編碼基因含該結(jié)構(gòu)。 基因調(diào)控元件(如啟動(dòng)子)所含CpG島中的5mC會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與DNA的結(jié)合。 DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián)； 非甲基化一般與基因的活化相關(guān)聯(lián)； 而去甲基化往往與一個(gè)沉默基因的重新激活相關(guān)聯(lián),19,2021年2月2日,20,一、

7、DNA甲基化,2021年2月2日,20,5,3,CpG島主要處于基因5端調(diào)控區(qū)域。 啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島一般是非甲基化狀態(tài)的，其非甲基化狀態(tài)對(duì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄是必須的。 目前認(rèn)為基因調(diào)控元件（如啟動(dòng)子）的CpG島中發(fā)生5mC修飾會(huì)在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA的結(jié)合。因而DNA甲基化一般與基因沉默相關(guān)聯(lián),Rb基因,CpG 頻率,DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制,基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化可影響轉(zhuǎn)錄激活因子和其識(shí)別序列的結(jié)合，直接抑制基因表達(dá)。 甲基化的CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋白家族(MBD)識(shí)別，而后者通過(guò)吸引組蛋白去乙?；?HDAC)和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(HMT)等組蛋白修飾蛋白來(lái)改變?nèi)?/p>

8、色質(zhì)活性，間接影響基因表達(dá),直接干擾機(jī)制 (1,直接干擾機(jī)制 (2,間接機(jī)制,The methyl-CpG-binding proteins MeCP1 and MeCP2能夠與甲基化的DNA結(jié)合 MeCP2能夠招募Sin3a, HDACs，形成復(fù)合物，阻遏轉(zhuǎn)錄,MeCP2,Model for methylation-dependent gene silencing. The structural element of chromatin is the nucleosomal core, which consists of a 146-bp DNA sequence wrapped aroun

9、d core histones. Acetylation of the histones causes an open chromatin config-uration that is associated with transcriptional activity. Methylated cytosines are recognized by methyl-CpG-binding proteins (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, convert-ing

10、 the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery,DNA甲基化狀態(tài)的遺傳和保持： DNA復(fù)制后，新合成鏈在DNMT1的作用下，以舊鏈為模板進(jìn)行甲基化。（缺乏嚴(yán)格的精確性，95%） 甲基化并非基因沉默的原因而是基因沉默的結(jié)果，其以某種機(jī)制識(shí)別沉默基因，后進(jìn)行甲基化。 DNA全新甲基化。引發(fā)因素可能包括： DNA本身的序列、成分和次級(jí)結(jié)構(gòu)。 RNA根據(jù)序列同源性可能靶定的區(qū)域。 特定染色質(zhì)蛋白、組蛋白修飾或相當(dāng)有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu),2021年2月2

11、日,28,DNA去甲基化 主動(dòng)去甲基化 復(fù)制相關(guān)的去甲基化 在復(fù)制過(guò)程中維持甲基化酶活性被關(guān)閉或維持甲基化酶活性被抵制,一、DNA甲基化,2021年2月2日,28,DNA甲基化的檢測(cè)方法,1.甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶法 2.基于亞硫酸氫鹽修飾的方法 3.基于甲基化DNA特異結(jié)合富集方法,二、組蛋白修飾,組蛋白修飾是表觀遺傳研究的重要內(nèi)容。 組蛋白的 N端是不穩(wěn)定的、無(wú)一定組織的亞單位，其延伸至核小體以外，會(huì)受到不同的化學(xué)修飾，這種修飾往往與基因的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。 被組蛋白覆蓋的基因如果要表達(dá)，首先要改變組蛋白的修飾狀態(tài)，使其與DNA的結(jié)合由緊變松，這樣靶基因才能與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用。因此，組

12、蛋白是重要的染色體結(jié)構(gòu)維持單元和基因表達(dá)的負(fù)控制因子,組蛋白修飾種類 乙?；? 一般與活化的染色質(zhì)構(gòu)型相關(guān)聯(lián)，乙?；揎棿蠖喟l(fā)生在H3、H4的 Lys 殘基上。 甲基化- 發(fā)生在H3、H4的 Lys 和 Arg殘基上，可以與基因抑制有關(guān)，也可以與基因的激活相關(guān)，這往往取決于被修飾的位置和程度。 磷酸化- 發(fā)生與 Ser 殘基，一般與基因活化相關(guān)。 泛素化- 一般是C端Lys修飾，啟動(dòng)基因表達(dá)。 SUMO（一種類泛素蛋白）化- 可穩(wěn)定異染色質(zhì)。 其他修飾（如ADP的核糖基化,Bryan M. Turner, nature cell biology, 2007,組蛋白中被修飾氨基酸的種類、位置和修

13、飾類型被稱為組蛋白密碼（histone code），遺傳密碼的表觀遺傳學(xué)延伸，決定了基因表達(dá)調(diào)控的狀態(tài)，并且可遺傳,主要的功能基團(tuán),Acetyl Methyl Phosphoryl Ubiquitin,組蛋白的共價(jià)修飾,組蛋白修飾,組蛋白修飾 (2,組蛋白的乙?；?1. 通常發(fā)生在蛋白質(zhì)的賴氨酸(K)上； 2. 可逆的生化反應(yīng)： A. Histone acetyltransferase，HAT (30) B. Histone deacetylase, HDAC (18) 3. 分子效應(yīng)：中和賴氨酸上的正電荷，增加組蛋白與DNA的排斥力 4. 生物學(xué)功能： A. 基因轉(zhuǎn)錄活化 B. DNA損傷修

14、復(fù),組蛋白的甲基化,1. 主要發(fā)生在賴氨酸(K)或精氨酸(R)上； 2. Long-term； 3. HKMTs (histone lysine methyltransferases) vs. PRMTs (protein arginine methyltransferases) 4. 可逆的生化反應(yīng)? 5. 分子效應(yīng)：增加賴氨酸上的疏水力 6. 生物學(xué)功能： A. 基因轉(zhuǎn)錄活化 B. 基因轉(zhuǎn)錄沉默 C. X染色體失活 D. 異染色質(zhì)致密狀態(tài) (heterochromatin compaction,組蛋白乙?；⒓谆约癉NA甲基化的關(guān)系,A. MBD結(jié)合甲基化的DNA, 招募HDAC, 組

15、蛋白去乙?；? 招募HMT, 甲基化組蛋白, 轉(zhuǎn)錄沉默； B. 組蛋白無(wú)乙?；揎? MBD結(jié)合甲基化的DNA, 再與SET結(jié)合，甲基化組蛋白 C. 甲基化的組蛋白尾部招募DNMT，對(duì)基因長(zhǎng)期沉默,組蛋白的SUMO化,1. 通常發(fā)生在賴氨酸(K)上； 2. 可逆的生化反應(yīng)： A. E1, E2, & E3 B. SENPs 3. 生物學(xué)功能： A. 轉(zhuǎn)錄沉默 B. 抑制組蛋白的乙?；图谆?組蛋白共價(jià)修飾的功能,基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、染色體凝聚等,組蛋白修飾的檢測(cè)方法,1.免疫染色 2.染色質(zhì)免疫共沉淀 3.質(zhì)譜,三、染色質(zhì)重塑,染色質(zhì)重塑（chromatin remodel

16、ing）是一個(gè)重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。 染色質(zhì)重塑是由染色質(zhì)重塑復(fù)合物介導(dǎo)的一系列以染色質(zhì)上核小體變化為基本特征的生物學(xué)過(guò)程。 組蛋白尾巴的化學(xué)修飾（乙?；?、甲基化及磷酸化等）可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而影響鄰近基因的活性,核小體,核小體定位是核小體在DNA上特異性定位的現(xiàn)象。 核小體核心DNA并不是隨機(jī)的，其具備一定的定向特性。 核小體定位機(jī)制： 內(nèi)在定位機(jī)制：每個(gè)核小體被定位于特定的DNA片斷。 外在定位機(jī)制：內(nèi)在定位結(jié)束后，核小體以確定的長(zhǎng)度特性重復(fù)出現(xiàn)。 核小體定位的意義： 核小體定位是DNA正確包裝的條件。 核小體定位影響染色質(zhì)功能,染色質(zhì)重塑,染色質(zhì) (Chromatin): 染色體上高

17、度致密的部分，通常不表達(dá)基因,常染色質(zhì)與異染色質(zhì),1. 常染色質(zhì)：基因表達(dá)活躍的區(qū)域，染色體結(jié)構(gòu)較為疏松 2. 異染色質(zhì)：基因表達(dá)沉默的區(qū)域，染色體結(jié)構(gòu)致密,核小體,常染色質(zhì),異染色質(zhì),染色體上不同的區(qū)域,Euchromatin: 常染色質(zhì)； Heterochromatin: 異染色質(zhì) E-H或H-稱為染色質(zhì)重塑(Chromatin Remodeling) 分子機(jī)理：DNA甲基化，組蛋白修飾，染色質(zhì)重塑復(fù)合物的協(xié)同作用,染色質(zhì)重塑的假設(shè)步驟,1. 兩類酶調(diào)控染色質(zhì)重塑的過(guò)程：組蛋白修飾因子 (histone modifiers) 以及ATP依賴的染色質(zhì)重塑因子 (chromatin remod

18、elers) 2.組蛋白修飾因子并不改變核小體的位置，而是在DNA上作標(biāo)記，以招募其他的活性成分 (組蛋白密碼) 3.染色質(zhì)重塑因子：水解ATP釋放能量，從而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu) 4.染色質(zhì)重塑因子復(fù)合物,Ch11 opener p447,染色質(zhì)重塑因子,核小體,染色質(zhì)重塑因子與核小體的相互作用,組蛋白的乙酰轉(zhuǎn)移酶的結(jié)合活化相應(yīng)區(qū)域,去凝聚狀態(tài)的染色質(zhì),活性染色質(zhì)的產(chǎn)生,組蛋白乙酰化酶 染色質(zhì)重塑復(fù)合物,組蛋白去乙?；?染色質(zhì)重塑復(fù)合物,Mediator-Pol II復(fù)合物：識(shí)別活化區(qū)域,OFF,ON,trxG,保持活性狀態(tài) (open chromatin,PRE,Target gene,組蛋白

19、的乙?；图谆?(TAC1 and ASH1 complexes,組蛋白的去乙酰化和甲基化 (ESC-E(Z) complex,保持沉默狀態(tài) (compact chromatin,PcG,染色質(zhì)重塑 - H2A Ubiquitination (PRC1 complex,染色質(zhì)重塑 (BRM complex,Ac,Me K27 H3,Me K4 H3,Ub H2A,Pc-G vs. trx-G：作用機(jī)制,染色質(zhì)修飾與重塑（共價(jià)修飾型與ATP依賴型,ATP依賴的染色質(zhì)重構(gòu)機(jī)制,四、RNA調(diào)控,1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。 1998，RNAi概念的首次提出。 1999，RNAi作用機(jī)制

20、模型的提出。在線蟲、果蠅、擬南芥及斑馬魚等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。 2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。RNAi 技術(shù)被Science評(píng)為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。 至今，蓬勃發(fā)展，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一,RNA干擾（RNAi）作用是生物體內(nèi)的一種通過(guò)雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘導(dǎo)特異性序列基因沉默的過(guò)程。 由于RNAi發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，所以又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS ）。 RNA干擾是一種重要而普遍表觀遺傳的現(xiàn)象,siRNA siRNA結(jié)構(gòu)：21-23nt的雙鏈

21、結(jié)構(gòu)，序列與靶mRNA有同源性，雙鏈兩端各有2個(gè)突出非配對(duì)的3堿基。 siRNA功能：是RNAi 作用的重要組分，是RNAi發(fā)生的中介分子。內(nèi)源性siRNA是細(xì)胞能夠抵御轉(zhuǎn)座子、轉(zhuǎn)基因和病毒的侵略,siRNA介導(dǎo)的RNAi,siRNAi 的特點(diǎn)： 高效性和濃度依賴性 特異性 位置效應(yīng) 時(shí)間效應(yīng) 細(xì)胞間RNAi的可傳播性 多基因參與及ATP依賴性,miRNA 結(jié)構(gòu)：21-25nt長(zhǎng)的單鏈小分子RNA ，5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)，3端為羥基，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成。 特點(diǎn)：具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性 。 功能,siRNA介導(dǎo)的RNAi,五、其他表觀遺傳機(jī)制,除DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、和RNA調(diào)控以外，還有遺傳印跡、X染色體失活、轉(zhuǎn)座、負(fù)突變等。 遺傳印跡、X染色體失活的本質(zhì)仍為DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑,遺 傳 印 跡,概念： 或稱親本印跡（parent imprinting） 是指基因組在傳遞遺傳信息的過(guò)程中，通過(guò)基因組的化學(xué)修飾（DNA的甲基化；組蛋白的甲基化、乙酰