果蠅唾腺染色體的標(biāo)本制備和觀(guān)察

1、果蠅唾腺染色體的標(biāo)本制備和觀(guān)察摘要多線(xiàn)染色體存在于某些生物特定生命周期的某些細(xì)胞中。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察的多線(xiàn)染色體是果蠅唾腺染色體，在其染色體標(biāo)本中可以觀(guān)察到果蠅唾腺染色體形態(tài)巨大，由5條長(zhǎng)染色體和1條短小的染色體組成，他們聚集在染色中心，橫紋條帶深淺不一，疏密各異，遍布每條多線(xiàn)染色體臂，有些地方有還脹泡出現(xiàn)。由于多線(xiàn)染色體因其形態(tài)巨大，橫紋明顯，它常被作為基因定位的良好材料，并且廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、發(fā)生遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)的研究中。關(guān)鍵詞 多線(xiàn)染色體 果蠅唾腺染色體橫紋 脹泡1.引言染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，作為DNA的載體，有著不可或缺的的作用，因此是科學(xué)家廣泛研究的材料。然而染色體

2、的研究通常面臨兩個(gè)困難：一是染色體很?。欢浅龢O少數(shù)動(dòng)植物，如玉米粗線(xiàn)期的染色體上具有染色粒這樣的結(jié)構(gòu)可以作為識(shí)別或定位的標(biāo)志外，大多數(shù)生物的染色體都沒(méi)有標(biāo)志。而多線(xiàn)染色體的染色體足夠大，染色體上的識(shí)別標(biāo)記足夠多，這將對(duì)遺傳學(xué)研究將提供不少的便利。本次實(shí)驗(yàn)觀(guān)察的多線(xiàn)染色體有如下特征： 果蠅唾腺染色體是一種纜狀的巨大染色體。由于果蠅幼蟲(chóng)的唾腺細(xì)胞發(fā)育至一定階段就停止有絲分裂，終止在間期，但唾液腺細(xì)胞核的染色體仍不斷地進(jìn)行自我復(fù)制，但并未發(fā)生細(xì)胞核分裂，復(fù)制后的子染色體彼此不分開(kāi)，形成了多線(xiàn)染色體，對(duì)于黑腹果蠅唾腺染色質(zhì)的復(fù)制可達(dá)9次之多，單條染色體臂可達(dá)275m，約為普通中期染色體的150倍。果

3、蠅唾腺染色體由5條長(zhǎng)染色體和1條短小的染色體組成，他們聚集在染色中心。唾腺染色體由于體聯(lián)會(huì)的原因只有二倍體的單元數(shù)，第染色體（X染色體）為端著絲粒，所以染色體的一端在染色中心上，另一端游離，第、染色體均為中著絲粒，它們從染色體中心呈V字形向外伸展，所以分別能看到2L(left arm)、2R( right arm) 、3L和3R4條長(zhǎng)臂；點(diǎn)狀的第染色體很短小，為端著絲粒。因此，可以見(jiàn)到5條很長(zhǎng)的和一條緊靠染色體中心的短小的染色體。在雄性幼蟲(chóng)中，唾腺染色體上不見(jiàn)Y染色體，它不與X染色體聯(lián)會(huì)，而且其著絲粒及其附近的異染色質(zhì)參與染色中心的形成。這可能是雄性幼蟲(chóng)唾腺染色體中的X染色體比其他幾對(duì)常染色體

4、相對(duì)狹窄一些的緣故。染色中心是唾腺染色體形成時(shí)，各條染色體的著絲粒和近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)聚積在一起形成一種結(jié)構(gòu)，此處的染色質(zhì)連接不緊密，橫紋結(jié)構(gòu)也不明顯。果蠅唾腺染色體橫紋條帶深淺不一，疏密各異，遍布每條多線(xiàn)染色體臂。染色質(zhì)絲的不同部位螺旋化程度不同。其中螺旋化程度較高的形成染色較深的暗紋，螺旋化程度較低的部位形成了染色較淺的明紋。橫紋數(shù)量巨大，在黑腹果蠅中可達(dá)5000多條。果蠅唾腺染色體每一臂上所有的橫紋的數(shù)目、大小和位置是恒定的，即具有種的特征，橫紋又與某些特定的基因相聯(lián)系，因此其可以作為基因定位的依據(jù)，橫紋數(shù)目和排列的變化可以作為染色體結(jié)構(gòu)改變（缺失、倒位、易位等）的依據(jù)。果蠅唾腺染色體

5、臂上可觀(guān)察到脹泡。當(dāng)基因活躍轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，多線(xiàn)染色體上的DNA會(huì)解開(kāi)螺旋，染色體某些帶紋變得疏松膨大而形成脹泡。不論是在經(jīng)典的細(xì)胞遺傳學(xué)時(shí)代還是在當(dāng)今的基因組學(xué)時(shí)代，多線(xiàn)染色體都為遺傳學(xué)尤其是果蠅的遺傳學(xué)研究提供了不少便利，這種便利是其他一些物種通常所不具備的。雙翅目昆蟲(chóng)多線(xiàn)染色體的原位雜交方法可以確定一條RNA或DNA序列在染色體上位置，將許許多多的DNA序列與果蠅的多線(xiàn)染色體進(jìn)行原位雜交，就可以了解這些序列在果蠅染色體上的順序，進(jìn)而拼接出一長(zhǎng)段甚至一條染色體的DNA順序。果蠅的基因組測(cè)序就利用了這種方法。而在不具備多線(xiàn)染色體的物種中要拼接DNA序列就困難多了。這就是制備多線(xiàn)染色體至今仍是果蠅

6、遺傳學(xué)研究的基本技術(shù)的原因。唾腺染色體廣泛應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)、發(fā)生遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)的研究中。唾腺染色體的制片是研究唾腺染色體的關(guān)鍵步驟，本實(shí)驗(yàn)用壓片法進(jìn)行制片觀(guān)察果蠅的唾腺染色體。2.材料和方法2.1 材料、試劑和器材實(shí)驗(yàn)材料：果蠅的三齡幼蟲(chóng)。實(shí)驗(yàn)試劑：生理鹽水（0.9%NaCI溶液）、蒸餾水、1mol/L HCl、45%乙酸、改良苯酚品紅染液實(shí)驗(yàn)器材：顯微鏡、解剖鏡、兩根解剖針（針尖要尖細(xì)些好）、載玻片、蓋玻片（20mm20mm）、濾紙條（約0.5mm3mm）、小毛筆。2.2 方法2.2.1三齡幼蟲(chóng)的飼養(yǎng)飼養(yǎng)方法一般遵循以下規(guī)則：培養(yǎng)基富含營(yíng)養(yǎng)。按果蠅培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基。在一齡

7、幼蟲(chóng)出現(xiàn)后，每天在培養(yǎng)基表面薄薄地滴上一層用新鮮的酵母或干酵母配成的2%4%的水溶液，作為幼蟲(chóng)的補(bǔ)充食物，二、三齡幼蟲(chóng)期則滴加10%左右的酵母液；蟲(chóng)口密度要小。在一新的培養(yǎng)瓶中接種10對(duì)左右親蠅，24小時(shí)后即把它們清除，這樣就不會(huì)因瓶中蟲(chóng)口密度太大而影響幼蟲(chóng)發(fā)育；低溫培養(yǎng)。在1820的低溫下培養(yǎng)最好，25培養(yǎng)也行。2.2.2剝離唾腺要獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選材是關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)選擇在培養(yǎng)頻壁上胖胖的稍微有些發(fā)黃的，身體不動(dòng)，頭時(shí)不時(shí)微微擺動(dòng)的三齡幼蟲(chóng)。這種幼蟲(chóng)染色體條帶清晰。在一張干凈的載玻片上滴一滴生理鹽水，用小毛筆從果蠅三齡幼蟲(chóng)培養(yǎng)瓶中選擇適宜的三齡幼蟲(chóng)置于載玻片上的生理鹽水中。將載玻片置于解

8、剖鏡下，取兩根解剖針，每只手各持一個(gè)解剖針，在解剖鏡下進(jìn)行操作。由于果蠅的唾腺位于幼蟲(chóng)體前1/31/4處，所以左手持解剖針按壓住蟲(chóng)體前端三分之一的部位，固定幼蟲(chóng)，右手持解剖針扎住幼蟲(chóng)頭部口器部位，適當(dāng)用力向右拉唾腺，腺體隨之而出，從而找到唾腺（唾液腺透明，旁邊附著黑色細(xì)長(zhǎng)脂肪）。用解剖針去除唾腺以外的組織，再小心剔除唾腺上的脂肪。剝離清楚的唾腺是肉眼可辨的一個(gè)很小的白點(diǎn)，看清這個(gè)小點(diǎn)有利于下面的操作。2.2.3 解離和染色(1)用HCl解離解離：在唾腺組織上滴一滴1mol/L HCl，解離2-3min ，使組織松軟，利于染色體的分散。解離完畢吸去HCl。水洗：用水沖洗2-3次。前兩次每次 12

9、 分鐘。用濾紙小心吸去多余的蒸餾水。染色：滴加一滴（約25微升）改良苯酚品紅染液，染色5-10分鐘。染色時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則背景也著色。(2)用45%乙酸解離解離：加一滴45%乙酸30s，用濾紙條小心洗凈溶液。水洗：用水沖洗2-3次。前兩次每次 12 分鐘。用濾紙小心吸去多余的蒸餾水。染色：滴加一滴（約25微升）改良苯酚品紅染液，染色5-10分鐘。染色時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則背景也著色。2.2.4壓片染色完成后，將載玻片放在平整的臺(tái)板上，蓋上干凈的蓋玻片。蓋前一定要小心地吸去多余的染料。用干凈的濾紙條蓋住蓋玻片的一角，左手壓在濾紙條上按住蓋玻片，右手持解剖針用針尖垂直地、螺旋形由中間向四周輕輕地敲擊蓋

10、玻片，注意不能移動(dòng)蓋玻片（此步驟可在解剖鏡下觀(guān)察）。最后用兩層濾紙覆蓋在蓋玻片上，用兩個(gè)拇指垂直用力按壓，按壓時(shí)不能讓蓋片滑動(dòng)，否則會(huì)造成染色體的扭斷斷裂。2.2.5鏡檢先用低倍鏡進(jìn)行觀(guān)察，尋找染色體臂分散良好的標(biāo)本，找到后將其移至視野中央，換用高倍鏡觀(guān)察染色中心、蓬突、橫紋、間紋及根據(jù)臂末端特征辨認(rèn)各條臂。3.結(jié)果3.1 結(jié)果觀(guān)察圖1 圖23.2 結(jié)果分析唾腺染色體從染色中心向四周放射狀地伸出5長(zhǎng)1短的6條臂。染色中心(箭頭指向)染色質(zhì)連接不緊密，橫紋結(jié)構(gòu)也不明顯。黑腹果蠅的體細(xì)胞染色體數(shù)是8，其中第染色體（X染色體）是端著絲粒染色體，在形成唾腺染色體時(shí)，著絲粒附著在染色中心，另一端游離，僅

11、形成一條臂。這條臂的末端有一個(gè)永久性的蓬突；第染色體臂非常短，附在染色中心邊緣。第、染色體都是中部著絲點(diǎn)染色體，每條染色體呈“V”形向外伸展出兩條臂，形成2L、2R、3L、3R四條臂。這幾條染色體最容易辨認(rèn)的就是4號(hào)染色體和X染色體。4號(hào)染色體染色體臂非常短，附在染色中心邊緣；4號(hào)染色體末端有一個(gè)永久性的蓬突；其他四條染色體不容易辨認(rèn)，但是可以通過(guò)以下特征加以區(qū)分：2L和2R染色體較之于3L和3R染色體末端較窄。2L染色體末端有尖尖的突起，橫紋不明顯；2R染色體末端橫紋明顯；3R末端肥大；3L離末端不遠(yuǎn)處有條帶較深的鼓起。也可以根據(jù)染色體的長(zhǎng)度來(lái)判斷量量配對(duì)的染色體。此次呈現(xiàn)的兩張圖中，圖1染

12、色體臂伸展較開(kāi)，但是清晰度不足，圖2染色體很清晰，但是伸展得不夠開(kāi)，兩圖可以?xún)?yōu)勢(shì)互補(bǔ)。4.討論（1）多線(xiàn)染色體在許多消化道或消化腺的組織中均存在，但觀(guān)察多線(xiàn)染色體多用三齡幼蟲(chóng)的唾腺，這是因?yàn)橥傧僖子趧內(nèi)∏移渲械娜旧w較大的原因。（2）選材時(shí)應(yīng)選擇在培養(yǎng)頻壁上胖胖的稍微有些發(fā)黃的，身體不動(dòng)，頭時(shí)不時(shí)微微擺動(dòng)的三齡幼蟲(chóng)。這種幼蟲(chóng)染色體條帶清晰。（3）識(shí)別唾腺時(shí)抓住幾個(gè)特征：第一，它是上小下大的囊狀結(jié)構(gòu)，唾腺旁附著帶狀的脂肪，在解剖鏡下（用側(cè)或頂光源照明）可見(jiàn)唾腺是接近透明的結(jié)構(gòu)，而脂肪常呈黑色；第二，唾腺上的細(xì)胞較大，在解剖鏡下依稀可見(jiàn)輪廓，放在顯微鏡的低倍鏡上下調(diào)焦可清楚地看到；第三，唾液腺較透

13、明，而腸子顏色偏黃并且很長(zhǎng)，不要將二者混淆。（4）清除唾腺周?chē)闹窘M織時(shí)要量力而行。（5）剝離唾腺時(shí)一定要加生理鹽水，否則唾腺易干。不過(guò)生理鹽水的量不可太多，否則果蠅幼蟲(chóng)會(huì)漂浮而且活躍。若生理鹽水較多，要在剝離唾腺前吸走一些，但唾腺剝離后不要吸生理鹽水，以防將唾腺一起吸走。（6）為了避免用濾紙吸溶液（生理鹽水、蒸餾水、HCl或醋酸）時(shí)將唾腺吸走，可以用以下方法解決：用濾紙吸去溶液時(shí)將載玻片稍?xún)A斜，此時(shí)液體順著載玻片往下流，唾腺則會(huì)附著在載玻片上。肉眼辨別唾腺的位置，然后在距唾腺一定距離的下游小心地將液體吸走。（7）滴加一滴（約25微升）改良苯酚品紅染液，染色液勿過(guò)多，否則壓片時(shí)唾腺容易隨染色液漂走溢出玻片外，同時(shí)亦不便于壓片的操作，不妨先用一張空白的玻片試驗(yàn)一下留多少染料合適。染色時(shí)若染液干了，應(yīng)再少加些染色液，再慢慢蓋上蓋波片，避免氣泡產(chǎn)生。（8）染色5-10分鐘。染色時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則背景也著色并且橫紋也會(huì)不明顯。同時(shí)染色時(shí)間也不可過(guò)短，否則染色太淺橫紋也不明顯。（9）染料若是有黑色雜質(zhì)，要在解剖鏡下觀(guān)察雜質(zhì)是否將唾腺覆蓋。如果覆蓋了，要小心剖去雜質(zhì)，盡量不要損害唾腺細(xì)胞。（10）敲片時(shí)用干凈的濾紙條蓋住蓋玻片的一角，左手壓在濾紙條上按住蓋玻片，右