對氧磷酯酶亞型1對小鼠巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制

1、對氧磷酯酶亞型1對小鼠巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制對氧磷酯酶(Paraoxonase,PON)是一類鈣依賴性的催化水解磷酸酯鍵的芳香酯酶,因其常見底物為對氧磷而命名。其包括PON1、PON2和PON3三種亞型,其中PON1主要由肝臟合成分泌入血、高親和結(jié)合于高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),是HDL發(fā)揮抗氧化及抗炎的主要成分。大量流行病學(xué)調(diào)查表明,人群中可因PON1基因多態(tài)性、衰老、冠心病、糖尿病、代謝綜合征等代謝性疾病因素出現(xiàn)血清PON1活性降低,我們前期的調(diào)研也認(rèn)為,血清低PON1活性可作為評估冠心病事件發(fā)生及嚴(yán)重程度的一種危險標(biāo)志。一系列實驗研究 也 證 實

2、,PON1具 有 抗 動 脈 粥 樣 硬 化 的 作用:PON1基 因 敲 除 (PON1 gene knockout,PON1-/-)小鼠可觀察到體內(nèi)HDL更容易氧化,低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)氧化明顯增加,高脂條件下更易導(dǎo)致動脈粥樣斑塊形成;在apoE基因敲除小鼠中高表達(dá)PON1,HDL抗氧化能力增強(qiáng),可有效減緩粥樣斑塊的發(fā)展;細(xì)胞實驗也發(fā)現(xiàn),PON1轉(zhuǎn)基因或高表達(dá)可降低巨噬細(xì)胞過氧化物水 平,顯 著 抑 制 炎 癥 因 子 腫 瘤 壞 死 因 子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)

3、和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的合成和分泌,明顯改善巨噬細(xì)胞的炎癥氧化狀態(tài)。盡管PON1確切的作用底物及相關(guān)機(jī)制仍未徹底闡明,但其抗炎抗氧化活性顯然對于抗動脈粥樣硬化效應(yīng)有重要意義。因此,本研究擬構(gòu)建含人源性PON1基因的慢病毒載體,旨在真核細(xì)胞高效表達(dá)分泌PON1,為進(jìn)一步研究PON1的生理性底物、相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生機(jī)制及臨床診治奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 主要材料與試劑人胚腎上皮293T細(xì)胞購于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心;pWPI-GFP慢病毒表達(dá)載體受贈于美國South Carolina大學(xué)醫(yī)學(xué)院樊大平博士;來源于人肝cDNA文庫含PON1的pUC載體購于

4、Genecopoeia公司;質(zhì)粒提取試劑盒購于TIANGEN公司;LB培養(yǎng)基為OXOID公司產(chǎn)品;PCR相關(guān)試劑為Takara公司產(chǎn)品;DNA凝膠純化回收試劑盒購于Axygen公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、小牛血清購自Gibco公司;對氧磷 (paraox-on)、巰基乙酸鹽肉湯(thioglycollate broth)為Sigma公 司 試 劑;LDL購 于ProSpec-Tany公 司;蛋 白Marker、核酸Marker、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒源于Pro-mega公司;RIPA裂解液購于碧云天生物技術(shù)研究所;PON1抗體、羊抗小鼠IgG為Abcam公司產(chǎn)品;ECL化學(xué)顯影液購于Thermo

5、公司;TNF-α、IL-6的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購于eBioscience公司;其它試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 pWPI-PON1重組載體的構(gòu)建根據(jù)慢病毒載體圖譜及購買的pUC19質(zhì)粒中PON1序列,設(shè)計定點突變PCR的特異寡核苷酸引物,即于目的基因的5′端 添 加 上Pme酶 切 位 點,上 游 引 物5′-TACGTTTAAACTCCCCGACCATGGCGAAG-3′,下游 引 物5′-GGCGGCGTTTAAACTTAGAG CT-CACA GTAA-3′(下劃線標(biāo)記處為Pme

6、 酶切位點),引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增長度為1 068bp。PCR條件(95 變性,55 退火,72延伸)PCR反應(yīng)后,產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA條帶位置。用限制性內(nèi)切酶Pme分別對PON1擴(kuò)增產(chǎn)物及pWPI-GFP慢病毒載體進(jìn)行酶切(37 水浴4h),并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離,采用凝膠純化回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物,進(jìn)而在T4連接酶作用下于16連接過夜。次日,連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì) 菌DH5α,鋪 于 含 氨 芐 青 霉 素 (ampicillin,Amp)的LB培養(yǎng)平板上過夜培養(yǎng),第2天可挑取單菌落接種于小量含Amp的LB液體

7、培養(yǎng)基中,振搖過夜,收集菌體進(jìn)行質(zhì)粒小量提取及瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組子;純化重組質(zhì)粒送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序,確證插入目的序列的正確方向,無堿基突變。1.2.2 pWPI-PON1重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞將對數(shù)生長期的293T細(xì)胞接種于直徑10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,給予10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待密度至40%-50%且細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前2h細(xì)胞換液(全培養(yǎng)基)。在兩個無菌圓底試管中分別用500μl溶液準(zhǔn)備預(yù)混的磷酸鈣轉(zhuǎn)染體系:管1含20μg DNA、62μl 2mol/L CaCl2;管2為2×H

8、EPES緩沖液(pH 7.1),將管1溶液逐滴加入管2并渦旋震蕩,室溫孵育20min后,逐滴加入293T細(xì)胞培養(yǎng)板并混勻,12h后更換新的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,分別于0,12,24,36,48及60h時間點用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況,并收取0.2ml培養(yǎng)基,用于測培養(yǎng)基中PON1含量和活性。1.2.3 Western blotting檢測培養(yǎng)基中PON1的含量不同時間點收集的培養(yǎng)基加5×凝膠上樣緩沖液處理,取35μl進(jìn)行10% SDS-PAGE分離,將凝膠中 蛋 白 電 轉(zhuǎn) 移 至 硝 酸 纖 維 素 膜,再 依 次 進(jìn) 行PON1一抗孵育、洗膜、二抗

9、孵育、洗膜及ECL化學(xué)發(fā)光法顯影,以凝膠成像系統(tǒng)掃描分析,檢測樣品中目標(biāo)蛋白的相對含量。1.2.4 PON1活性測定將轉(zhuǎn)染后不同時間點收取的細(xì)胞培養(yǎng)液,按本室建立的方法測定PON1活性,即:采用酶水解底物對氧磷為對硝基酚的原理,以100 mmol/L Tris-Cl緩沖液(pH 8.5)建立200μl的分析體系:含50μl樣品、1.2mmol/L對氧磷、2mmol/L CaCl2、2mol/L NaCl,于25 下,利用酶標(biāo)儀(Eon,Biotek公司)在405nm處連續(xù)掃描記錄4min內(nèi)產(chǎn)物生成速率。以每升血清(培養(yǎng)基)每分鐘生成產(chǎn)物對硝基酚的微摩爾數(shù)μmol/(min&m

10、iddot;L)表示1個PON1酶活性單位值(用kU/L表示單位)。1.2.5 小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)與氧化模型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞取材于C57BL/6小鼠(購于武漢大學(xué)A3動物中心),實驗前于小鼠腹腔內(nèi)注射3%巰基乙酸鹽肉湯3ml,第4天將小鼠安樂死,收集腹腔PBS灌洗液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)以1×106/孔鋪于6孔細(xì)胞板,以10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),24h后換為1ml新鮮無血清高糖DMEM培養(yǎng)基,同時加入2ml慢病毒載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h的培養(yǎng)基,氧化組以10mg/L氧化 型LDL(oxidative LDL,ox-LDL)10μmol/LCu2+與L

11、DL 1g/L,37共孵育24h,0.2mmol/LETDA(pH 7.4)終止反應(yīng),透析,0.45μm過濾獲得處理細(xì)胞建立氧化條件,細(xì)胞置于37 、5% CO2溫箱繼續(xù)孵育,收集6h時各孔的條件培養(yǎng)液及RIPA裂解液處理的細(xì)胞,留做炎癥因子的檢測分析。1.2.6 ELISA法檢測TNF-α、IL-6的水平培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6水平的檢測采用ELISA法按試劑盒說明進(jìn)行,于酶標(biāo)儀450nm處測量,每個樣本重復(fù)3次。每孔細(xì)胞以Lowry法測定RIPA裂解液蛋白含量,細(xì)胞分泌入培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6的含量以單位細(xì)胞蛋白量的TNF-α

12、、IL-6水平(ng/g細(xì)胞蛋白)表示。1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果以x珔±s表示,采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗,P2 結(jié)果2.1 pWPI-PON1重組慢病毒載體構(gòu)建與鑒定利用引物 設(shè) 計、PCR法 獲 得 兩 端 添 加 酶 切 位 點 的PON1基因,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中可見約1kb處有明亮的DNA條帶,與預(yù)期PON1條帶基本一致(圖1A)。將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pWPI載體經(jīng)酶切連接、轉(zhuǎn)化后,篩選單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)、提取質(zhì)粒,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定大小后送檢測序,測序結(jié)果證實第1、2號為構(gòu)建成功的pWPI-PON1

13、重組載體(圖1B)。2.2 pWPI-PON1重組體瞬時高效轉(zhuǎn)染以pWPI-GFP空載體為對照,利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將pWPI-PON1重組體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染換液后于0,12,24,36,48,60h不同時間點在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,可見慢病毒的高效轉(zhuǎn)染率(細(xì)胞GFP熒光陽性率可達(dá)到80%-90%),且隨時間延長,GFP蛋白表達(dá)量持續(xù)增高(圖2)。2.3 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基中PON1的含量與活性轉(zhuǎn)染后不同時間點收取細(xì)胞培養(yǎng)基,Western blotting檢測結(jié)果顯示,與pWPI-GFP轉(zhuǎn)染對照組比較,pWPI-PON1轉(zhuǎn)染組可高表達(dá)PON1并分泌入培養(yǎng)基中,PON1含 量 在60 h內(nèi) 呈

14、 時 間 依 賴 性 遞 增 趨 勢(圖3)。同時采用對氧磷為底物檢測PON1活性,pWPI-GFP轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞培養(yǎng)基中幾乎無PON1活性,而pWPI-PON1轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)基中PON1活性隨時間遞增而升高,且在48h可達(dá)最高(圖4)。2.4 培養(yǎng)基中PON1對巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6的影響采用ELISA法檢測PON1孵育對巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-6的影響,結(jié)果顯示(圖5),與基礎(chǔ)對照組相比,含PON1(活性為8.3kU/L)的培養(yǎng)基與巨噬細(xì)胞共孵育6h時,細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6的水平明顯降低P前期有研究利用PON1轉(zhuǎn)基因鼠來源的巨噬

15、細(xì)胞,證實細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)PON1可發(fā)揮其抗氧化抗炎而對動脈粥樣硬化有明顯防御作用。但小鼠腹腔巨噬細(xì)胞或骨髓來源的巨噬細(xì)胞幾乎不表達(dá)PON1。PON1主要從肝臟合成后分泌入血,因此,為更好闡明循環(huán)中PON1對巨噬細(xì)胞的影響,我們選擇了慢病毒表達(dá)系統(tǒng),此類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)不斷完善,可使外源基因長效、穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白,有利于代謝性疾病等慢性病研究中的長效動物實驗,已成為基因功能研究和臨床治療最有應(yīng)用前景的生物工具。本實驗中利用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染真核293T細(xì)胞,獲得了持續(xù)高活性PON1的表達(dá)分泌,進(jìn)一步與小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞共孵育,模擬了細(xì)胞外環(huán)境中PON1的作用方式,從而觀察到外源PON1顯著降低細(xì)胞炎癥,使其產(chǎn)生TNF-α、IL-6的水平明顯減少。有研究報道,PON1的抗炎作用可通過促使巨噬細(xì)胞清道夫受體BI(SRBI)的高表達(dá),抑制TLR-4活化,下調(diào)NF-κB介導(dǎo)的炎癥活化通路;也可能發(fā)揮抗凋亡而保護(hù)巨噬細(xì)胞。另有實驗證明,PON1可通過直接減少炎癥刺激引起的ROS水平,增強(qiáng)HDL抗炎活性。本實驗中采用熒光顯微鏡觀察到磷酸鈣轉(zhuǎn)染法可獲得外源蛋白的持續(xù)增加,培養(yǎng)基中PON1的活性也隨著升高,說明慢病毒載體對細(xì)胞的毒性影響并不顯著。對于60h內(nèi),熒光強(qiáng)