HPV16 E6和 Nanog基因shRNA對宮頸癌SiHa細(xì)胞影響的醫(yī)學(xué)研究

1、HPV16 E6和 Nanog基因shRNA對宮頸癌SiHa細(xì)胞影響的醫(yī)學(xué)研究第一章 前言宮頸癌是危害婦女健康的主要疾病之一，2012 年，全球?qū)m頸癌新發(fā)病例527,624 例，引起 265,653 例死亡，其中我國分別占 12%和 11%1。與大多數(shù)腫瘤一樣，宮頸癌的主要治療方法是手術(shù)和放療。盡管宮頸癌治療的臨床手術(shù)技巧不斷完善，醫(yī)療設(shè)備、藥物不斷改進(jìn)，手術(shù)、放療和化療得到綜合應(yīng)用，但是宮頸癌的治療效果和預(yù)后依然不理想，宮頸癌有很高的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險2, 3，因此，近些年來，研究學(xué)者不斷深入對宮頸癌的研究，希望能找到更好的治療方法。腫瘤的基因治療作為未來一種新的治療方法受到了越來越多研究學(xué)者

2、的重視。1.1 宮頸癌與 HPV 感染在所有惡性腫瘤中，宮頸癌是唯一有明確致病因素的癌癥4, 5，研究發(fā)現(xiàn)，超過 99.7%的宮頸癌患者的癌變組織中均可以檢測到 HPV 病毒 DNA 分子6。根據(jù) HPV 的致癌潛能，HPV 病毒被分為高低兩種型別，高危型別主要有 HPV-16，-18，-31，-33，-35，-39，-45，-51，-52，-56，-58，-59，-68，-73，-82，與癌變相關(guān)，低危型別主要有 HPV-6，-11，導(dǎo)致良性病變?nèi)缟称黟?，輕度鱗狀上皮增生7, 8。其中，以 HPV16 型致癌性最強(qiáng)，最容易導(dǎo)致患者發(fā)生持續(xù)性感染，進(jìn)而發(fā)展成為浸潤性宮頸癌9, 10。HPV

3、DNA 與宿主基因組的整合是宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化主要機(jī)制，病毒 DNA 分子整合入宿主細(xì)胞的基因組后會導(dǎo)致HPV 的主要致癌基因 E6、E7 的蛋白大量表達(dá)，E6 蛋白結(jié)合并降解抑癌蛋白 p53，另一方面可以抑制 p53 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，E7 蛋白結(jié)合并降解抑癌蛋白 pRb，使這些抑癌蛋白喪失抑癌功能，致使細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞生長失控，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，并逐步發(fā)展為侵襲性宮頸癌11。.1.2 宮頸癌與 Nanog 基因新近發(fā)展起來的腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是由腫瘤細(xì)胞中一小部分特殊細(xì)胞群所導(dǎo)致，這部分細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，能自我更新和分化出異質(zhì)性細(xì)胞。Nanog 基因

4、作為干細(xì)胞標(biāo)志物在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)同樣為這種假說提供了依據(jù)，而且有學(xué)者認(rèn)為 Nanog 有可能作為腫瘤診斷的一個敏感性、特異性標(biāo)志物和治療靶點。Nanog 基因是 2003 年 5 月發(fā)現(xiàn)的一個新的干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，主要起維持胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES 細(xì)胞）亞全能性的作用，與 ES 細(xì)胞增殖和分化關(guān)系密切12, 13。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，Nanog 基因作為腫瘤干細(xì)胞分子標(biāo)志物，在多種癌變組織中過表達(dá)，例如肺癌14、乳腺癌15、前列腺癌16、肝癌17、卵巢癌18, 19、結(jié)腸癌20和宮頸癌21。Nanog 基因在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)與癌癥患者預(yù)后密切相關(guān)2

5、0, 22-25。研究表明，Nanog 基因可以通過 STAT3/Snail 信號途徑來調(diào)控腫瘤細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial MesenchymalTransition，EMT）的改變及轉(zhuǎn)移和侵襲能力26-28，還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白 Cyclin D1 表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡29。Feng Ye 等人的研究發(fā)現(xiàn)，Nanog在不同病變程度的宮頸組織中表達(dá)量明顯不同，隨病變程度的加深，表達(dá)量逐漸升高，表達(dá)差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義30。沉默 Nanog 基因在宮頸癌細(xì)胞系 Hela細(xì)胞中的表達(dá)，可以減緩細(xì)胞的生長，減弱細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，增強(qiáng)其對藥物的敏感性25。綜上所述，我們推測腫

6、瘤干細(xì)胞標(biāo)記物 Nanog 基因在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)，可能與宮頸癌細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)，影響宮頸癌患者的治療效果和預(yù)后，可能成為治療宮頸癌的一個新的基因靶點和分子診斷的一個新的標(biāo)志物。.第二章 HPV16 E6 和 Nanog shRNA 真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定2.1 實驗材料2.1.1.細(xì)胞和載體人宮頸癌 SiHa 細(xì)胞株 北京北納生物研究院載體：pSilencer2.1-U6 美國 Invitrogen 公司菌株：大腸桿菌 DH5α 大連 Takara 公司2.1.2 主要的實驗試劑及工具酶DMEM 高糖培養(yǎng)基 美國 Gibco 公司Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基 美國 G

7、ibco 公司澳洲胎牛血清 美國 Gibco 公司磷酸鹽緩沖液 PBS 美國 Gibco 公司0.25%胰蛋白酶 美國 Gibco 公司T4 DNA 連接酶 大連 Takara 公司膠回收試劑盒 大連 Takara 公司質(zhì)粒小提試劑盒 大連 Takara 公司.2.2 實驗方法2.2.1 shRNA 的設(shè)計與合成通過 NCBI 從 Genebank 中選取人 HPV16 E6 和 Nanog 基因的 cDNA 序列，利用 Invitrogen 公司提供的網(wǎng)上 siRNA 在線設(shè)計軟件進(jìn)行設(shè)計，根據(jù)軟件給出的結(jié)果和 siRNA 的設(shè)計原則33，并查閱文獻(xiàn)資料，分別針對這兩個基因，從中各選取三條已

8、被證實有效的 siRNA 靶序列，同時設(shè)計一條陰性對照，七條序列分別進(jìn)行 BLAST 分析，結(jié)果與人類其它基因編碼序列無同源性。以設(shè)定的 siRNA靶序列為正義鏈，其反向互補(bǔ)的序列為反義鏈，將正義鏈和反義鏈加到以TTCAAGAGA 為莖環(huán)的兩端，在正義鏈的 5，加上限制性內(nèi)切酶 BamHI 粘端，反義鏈的 5，端加上 HandIII 粘端，3，端酶切位點之前加入啟動子終止信號TTTTTT ，將得到設(shè)計的 shRNA 分別命名為 shRNA-E6-1 、 shRNA-E6-2 、shRNA-E6-3、shRNA-Nanog-1、shRNA-Nanog-2、shRNA-Nanog-3、shRNA-

9、Control（見表2-1）。將上述設(shè)計的HPV16 E6 的shRNA序列shRNA-E6-1、shRNA-E6-2、shRNA-E6-3 ， Nanog 的 shRNA 序列 shRNA-Nanog-1 、 shRNA-Nanog-2 、shRNA-Nanog-3 及陰性對照 shRNA 序列 shRNA-Control 交由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。.第三章 HPV16 E6、Nanog shRNA 表達(dá)對 SiHa 細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.203.1 實驗材料.203.2 實驗方法.223.3 實驗結(jié)果.263.4 討論 .333.5 小結(jié) .373.5 小結(jié)本研究利用 RNAi

10、 技術(shù)，在基因轉(zhuǎn)錄水平上干擾 HPV16 E6 mRNA 的表達(dá)，不僅使宮頸癌細(xì)胞 SiHa 細(xì)胞中 E6 mRNA 表達(dá)下調(diào)，還可以下調(diào) Nanog 基因mRNA 和蛋白表達(dá)，間接說明 HPV16 E6 的表達(dá)可以誘導(dǎo) Nanog 基因的表達(dá)。沉默HPV16 E6和Nanog基因在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)，可以在一定程度上減緩SiHa細(xì)胞的生長速度，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，減弱細(xì)胞的遷移能力。HPV16 E6 和 Nanog基因兩者之間可能存在協(xié)同作用。.總結(jié)本研究采用 RNAi 技術(shù)，以人 HPV16 E6 和 Nanog 基因為作用靶點，成功構(gòu)建了 HPV16 E6 和 Nanog 基因的 shRN

11、A 真核表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染宮頸癌 SiHa細(xì)胞。RT-PCR 和 Western Blot 結(jié)果顯示 HPV16 E6 和 Nanog 基因的 shRNA 能有效沉默 E6 和 Nanog 基因在 SiHa 細(xì)胞中的表達(dá)，HPV16 E6 基因表達(dá)下調(diào)可以誘導(dǎo)Nanog基因的表達(dá)減少，HPV16 E6和Nanog基因的表達(dá)減少可以誘導(dǎo)STAT3、Cyclin D1 蛋白表達(dá)減少。通過 CCK-8 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果表明 HPV16 E6 和 Nanog 兩種基因 shRNA 可明顯抑制 SiHa 細(xì)胞的增殖，共轉(zhuǎn)染比單獨轉(zhuǎn)染對 SiHa 細(xì)胞的增殖速度抑制效果更強(qiáng)；Transwell 實驗結(jié)果顯示，HPV E6 和 Nanog 基因的沉默表達(dá)，可明顯減弱 SiHa 細(xì)胞的遷移能力，共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較單獨轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力更弱；細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，HPV16 E6 和 Nanog 基因的沉默表達(dá)使 SiHa 細(xì)胞的凋亡明顯增多，與單獨轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞明顯增加；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，HPV16 E6 和 Nanog 基因的沉默表達(dá)使 SiHa 細(xì)胞處于中 G0/G1 期細(xì)胞比例增多，處于 S 期細(xì)胞比例明顯減少，表明 HPV E6 和 Nanog 沉默表達(dá)使G0/G1 期的細(xì)胞不能順利進(jìn)入 S 期，延長了細(xì)胞的周期，減緩了細(xì)胞的增殖速度。綜上所述，我們得出結(jié)論：